Масштабирование Engineered сосудистых трансплантатов С помощью 3D печатных руководств и кольцо Метод Stacking

Общая цель этого метода заключается в надежном и последовательном создании инженерных кровеносных сосудов любого размера. Этот метод позволяет надежно и эффективно спроектировать кровеносные сосуды. Главное преимущество этой методики заключается в том, что суда любого размера могут быть легко и надежно изготовлены.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обсуждали, как спроектировать трубку из ткани, и сравнили наш метод со строительством дорожных туннелей, по одному сегменту за раз. Чтобы приготовить напечатанные на 3D-принтере вставки, сначала добавьте тонкий слой двух, четырех или шести мл неотвержденного силикона на дно чашки Петри диаметром 35, 60 или 100 миллиметров соответственно. Чтобы создать стойки для плит 35 мм, залейте PDMS в другую плиту 100 мм высотой семь мм и нагрейте PDMS на конфорке при температуре 60 градусов Цельсия в течение двух-трех часов.

Когда PDMS будет излечен, используйте пятимиллиметровый биопсийный перфоратор для создания цилиндрических штифтов. С помощью небольшого количества неотвержденного PDMS баллоны крепятся к центру каждой пластины диаметром 35 мм. Поместите напечатанную на 3D-принтере внешнюю оболочку диаметром около 66,7 мм на равном расстоянии от стойки в пластины диаметром 100 мм.

Перед тем, как PDMS в нижней части пластин диаметром 60 и 100 мм будет отверждена, поместите напечатанные на 3D-принтере стойки диаметром 10 и 20 мм в каждую пластину диаметром 60 и 100 мм соответственно. Дайте посуде застыть на открытом воздухе на конфорке с температурой 60 градусов Цельсия в течение двух-трех часов, после чего последует восемнадцать часов полимерной дегазации. В конце дегазации простерилизуйте внутренности всех тарелок с 70% этанолом и накройте каждую тарелку на 30 минут.

Затем осторожно отсасывайте этанол из каждой пластины, чтобы дать возможность высохнуть на воздухе. Когда пластины высохнут, переложите их в шкаф биологической безопасности рядом с соответствующими крышками лицевой стороной вверх. и подвергните материалы воздействию ультрафиолетового света в течение 30 минут, чтобы завершить стерилизацию.

Для приготовления гидрогеля Фибрина сначала добавьте 0,5, 1,1 и 1,81 мл питательной среды с добавлением геля Фибрин и TGF Beta 1 в чашки для культуры 35, 60 и 100 мм соответственно. Затем добавьте 40, 88,4 и 145 микролитров тромбина в пластины диаметром 35, 60 и 100 мм соответственно и аккуратно взболтайте каждую пластину вручную. Когда тромбин равномерно распределится, добавьте 160, 354 и 580 микролитров фибриногена по каплям круговыми движениями в смесь среды тромбина в пластинах 35, 60 и 100 мм соответственно и осторожно взболтайте пластины, чтобы равномерно распределить гидрогель.

Дайте гидрогелю застыть в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Затем трипсинизируют интересующие клетки гладкой мускулатуры, расширенные в 150 мм клеточных культуральных планшетах, и собирают оторвавшиеся клетки путем центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулы в трех мл дифференцировочной среды и с помощью пипетки объемом два мл энергично растирайте клетки, чтобы разбить любые клеточные комки.

После подсчета разделите клетки на 2/10 10 до 6-й, 1/10 до 7-й и 1,4 x 10 до 7-й клеток на мл аликвот в конических пробирках объемом 50 мл, помеченных в соответствии с соответствующими культуральными планшетами. Добавьте среду для дифференцировки в каждую пробирку для получения окончательных объемов посева в два, четыре и пять мл для каждой пластины диаметром 35, 60 и 100 мм соответственно. Затем осторожно добавьте растворы клеток по каплям на приготовленный гидрогель в каждой соответствующей пластине для расширения в инкубаторе для клеточных культур. Через два-четыре дня кольца полностью сузятся в направлении своих столбов.

Поэтому добавьте 10, 20 или 35 мл TGF Beta 1 к каждому кольцу 35, 60 и 100 мм соответственно. Чтобы собрать сосудистую конструкцию для сосуда диаметром 35 мм, отрежьте двухдюймовый отрезок от верхней части 50 мл поликарбонатной конической трубки, а PDMS приклейте верхний край в пластину диаметром 35 мм, чтобы создать высокую пластину для укладки колец. Для резервуара диаметром 60 и 100 мм для высоких кольцевых штабелирующих пластин поликарбонатная трубка диаметром 1,75 дюйма разрезается на секции диаметром 2,5 дюйма в длину, которые служат стенками высоких пластин.

Для высоких дна пластин разрежьте лист поликарбоната толщиной 0,125 дюйма на круглые кусочки диаметром два дюйма. С помощью акрилового растворителя цемента свяжите секции поликарбонатной трубы с круглыми разрезанными частями. 3D-печать столбов диаметром пять, десять и 20 мм и длиной 50 мм.

Затем добавьте 10 мл неотвержденного силикона в каждый контейнер, центрально помещая каждый напечатанный на 3D-принтере столб в каждый контейнер диаметром 35, 60 и 100 мм, прежде чем PDMS полностью отвержится. И поставьте посуду на конфорку с температурой 60 градусов Цельсия на два-три часа. Когда PDMS отверждается, простерилизуйте тарелки с 70% этанолом, как показано выше, с последующим воздействием на высушенные контейнеры из этанола ультрафиолетовым светом в течение 30 минут.

Теперь с помощью двух пар очень тонких щипцов осторожно приподнимите сначала одну, а затем другую сторону туго свернутого гидрогелевого кольца с гладкой мускулатурой. Затем осторожно сдвиньте одну сторону кольца, а затем другую на высокую стойку соответствующего контейнера большего размера. Работая по окружности, мягкими постепенными движениями, медленно проталкивайте кольцо вниз по столбу, впоследствии укладывая дополнительные тканевые кольца до тех пор, пока не будет получена желаемая длина сосуда.

Когда все кольца будут сложены, поверните пластины так, чтобы стойки были параллельны рабочей поверхности, и аккуратно добавьте 40, 80 и 160 микролитров тромбина на внешнюю поверхность каждого сосуда диаметром 35, 60 и 100 мм соответственно, медленно вращая пластины. Затем добавьте 40, 80 и 160 микролитров фибриногена в каждую конструкцию размером 35, 60 и 100 мм соответственно, как можно быстрее и равномернее, быстро вращая конструкцию. Тромбин и фибриноген быстро схватываются в твердый гель после смешивания.

Затем добавьте 20 мл дифференцировочной среды в каждый контейнер и поместите сосуды в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. Гистологический анализ выявляет высокую клеточность во всех размерах колец, при этом небольшое количество остаточного геля фибрина наблюдается на внешних краях малых колец. В больших кольцах некоторое количество геля фибрина перемежается с клеточным содержимым, при этом признаки выработки коллагена проявляются как в промежуточных, так и в больших кольцах.

Анализ тканевых колец на экспрессию альфа-гладкой мускулатуры, актина и тропомиозина показывает, что все размеры колец положительны для обоих антител, что подтверждает сохранение фенотипа гладкой мускулатуры. Испытание на растяжение указывает на устойчивую тенденцию увеличения прочности, коррелирующую с увеличением размера кольца и сосуда во всех трех размерах колец. Количество затравок ячеек для создания колец различных размеров также коррелирует с площадью поверхности затравки.

Эти конструкции сосудов также способны выдерживать поток до пяти минут при скорости потока от 100 до 417 мл в минуту, при этом наблюдаются лишь незначительные утечки в местах подключения сосудов к системе изобилия. После освоения кольца могут быть спроектированы за один час, если техника выполнена правильно. При выполнении этой процедуры важно помнить о тщательном смешивании компонентов гидрогеля, чтобы обеспечить схватывание геля и правильное образование кольца.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как создание колец других типов клеток, для инженерии других типов тканей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать метод кольцевой укладки для инженерии сосудистых тканей различных размеров.