HS-мно Assay для количественного определения белков клетки хозяина в области биофармацевтики белка по жидкостной хроматографии ионной подвижности QTOF масс-спектрометрии

Общая цель анализа HS-MRM заключается в уменьшении явления MRM-интерференции, которое влияет на количественное определение пептидов или белков, путем сочетания разделения ионной подвижности предшественников пептидов с масс-спектрометрическим детектированием фрагментных ионов с высоким разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биотерапевтической характеристики, а также количественного определения биомаркеров белков или пептидов и количественной протеомики. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет обнаруживать малораспространенные белки клетки-хозяина, которые могут присутствовать в биофармацевтических белках.

Во-первых, нажмите на кнопку «Создать метод анализа» в программном обеспечении для сбора данных и выберите «Генерировать и получать и обрабатывать метод». Введите имя и описание метода, перейдите в папку метода и нажмите кнопку «Далее». В качестве типа анализа выберите пептидную карту IMS и нажмите кнопку «Далее».

Затем выберите текущую конфигурацию системы, нажмите «Далее» и «Готово». Во вновь созданном методе нажмите на вкладку «Инструменты», выберите диспетчер бинарных растворителей и отредактируйте настройки градиента, чтобы добиться разделения пептидов со скоростью потока 0,2 миллилитра в минуту. Используйте градиентное разбавление от одного до 40% растворителя B в течение 30 минут с последующей двухминутной промывкой колонки и 10-минутной балансировкой с общим временем работы 45 минут.

Затем выберите менеджер образцов и установите температуру образца на 10 градусов Цельсия, а температуру столбца на 60 градусов Цельсия. На вкладке «Инструменты» выберите прибор Vion IMS QTof. В разделе настроек выберите чувствительность для режима анализатора и введите три киловольта для капиллярного напряжения, 100 градусов Цельсия для температуры источника, 250 градусов Цельсия для температуры десольватации, 50 литров в час для потока конусного газа и 500 литров в час для потока газа для растворения.

Перейдите на вкладку эксперимента и выберите режим MSE высокой четкости. Затем введите 100 для малой массы, 2000 для большой массы и 0,4 секунды для времени сканирования. В разделе «Энергия столкновения» введите шесть электрон-вольт для настройки с низким энергопотреблением и выберите высокую энергетическую линейность от 15 до 40 электрон-вольт.

Для времени сбора данных используйте пользовательское время выполнения от пяти до 30 минут. Далее перейдите на вкладку «Параметры» и выберите режим автоматической коррекции блокировки с интервалом автоматической коррекции блокировки в пять минут. Затем выберите опцию «Продолжить с коррекцией блокировки» и убедитесь, что автоматическая проверка датчика отключена.

В меню текущей конфигурации системы выберите прибор Vion IMS QTof и нажмите «Инструменты». Введите три киловольта для капиллярного напряжения, 40 вольт для конуса отбора проб, 100 вольт для смещения источника, 100 градусов Цельсия для температуры источника, 250 градусов Цельсия для температуры десольватации, 50 литров в час для потока конусного газа, 500 литров в час для потока растворенного газа и три киловольта для опорного капиллярного напряжения. Проанализируйте ранее подготовленный образец с искусственным шипом с 10 наномолярами с помощью только что описанного анализа LC-HDMSE путем введения 10 микролитров образца в прибор.

Здесь показаны отдельные последовательности шести стандартов пептида фосфорилазы В, содержащихся в смеси искусственных пептидов, а также время их удержания и наиболее распространенные предшественники, наблюдаемые в эксперименте HDMSE. Здесь представлены спектры HDMSE, полученные для одного из искусственных пептидов, спайкнутых в дайджесте инфликсимаба. В программном обеспечении для сбора данных нажмите «Создать метод анализа» и выберите «Генерировать и получать и обрабатывать метод».

Введите имя и описание метода, перейдите в папку метода и нажмите кнопку «Далее». В качестве типа анализа выберите количественную оценку, выберите Quantify Assay Tof 2D Chromatographic и нажмите далее. Затем выберите текущую конфигурацию системы, нажмите «Далее» и «Готово».

Нажмите на вкладку инструментов в только что созданном методе. Выберите диспетчер двоичных растворителей и отредактируйте настройки градиента, чтобы добиться разделения пептидов со скоростью потока 0,2 миллилитра в минуту. Используйте градиентное разбавление от одного до 40% растворителя B в течение 30 минут с последующей двухминутной промывкой колонки и 10-минутной балансировкой с общим временем работы 45 минут.

Во вкладке «Инструменты» выберите менеджер образцов и установите температуру образца на 10 градусов Цельсия, а температуру колонки на 60 градусов Цельсия. Теперь выберите прибор Vion IMS QTof и в разделе настроек выберите чувствительность для режима анализатора. Затем введите три киловольта для капиллярного напряжения, 100 градусов Цельсия для температуры источника, 250 градусов Цельсия для температуры десольватации, 50 литров в час для потока конусного газа и 500 литров в час для потока газа для десольватации.

Перейдите на вкладку эксперимента и в качестве типа эксперимента выберите таблицу функций одну или несколько функций MS, MSMS или MRM. Удалите функцию сбора данных по умолчанию, нажмите «Добавить плюс MRM» и отредактируйте параметры окна хранения в разделе времени выполнения. В редакторе функций Tof MRM введите коэффициент основного заряда пептидного предшественника, выберите низкое значение разрешения предшественника и введите состояние заряда прекурсора.

Затем введите коэффициент заряда 16 электрон-вольт для начальной энергии столкновения, 0,1 секунды для фиксированного времени сканирования и широкий для столбца спектра. С помощью кнопки дублировать добавьте еще 10 переходов MRM и используйте разные значения энергии столкновения в диапазоне от 18 до 36 электронвольт. После определения трех наилучших переходов для каждого пептида был проведен эксперимент Tof MRM, чтобы найти оптимальную энергию столкновения для максимизации сигналов, генерируемых для каждого пептида.

Затем настройте метод HS-MRM, содержащий только один ион фрагмента на пептид. Измените ранее созданный метод Tof MRM, выбрав функцию HS-MRM вместо функции Tof MRM. В редакторе функций HS-MRM введите коэффициент основного заряда, выберите низкий для разрешения прекурсора и введите состояние заряда прекурсора.

Затем введите значение предкурсора CCS и выберите низкое для параметра Разрешение предкурсора CCS. Для иона продукта введите его коэффициент заряда, выберите оптимальную энергию столкновения, выберите время сканирования 0,4 секунды и выберите настройку широкого спектра, чтобы включить все его изотопы. Окончательный анализ HS-MRM сохраняет только лучший переход для каждого пептида и используется для анализа всех образцов с шипами.

В методе анализа, созданном для метода сбора данных HS-MRM, перейдите на вкладку «Назначение» и выберите «Управление компонентами». В раскрывающемся меню в разделе Тип эксперимента выберите параметр HS MSMS/HS MRM. Нажмите «Создать» и введите имя компонента, ожидаемое время хранения, временное окно извлечения и коэффициент основного заряда прекурсора.

Выберите режим извлечения XIC и введите ожидаемое значение CCS. Для иона фрагмента введите его состояние заряда и коэффициент заряда мастера. Затем введите все пептидные компоненты, контролируемые с помощью анализа HS-MRM.

На вкладке «Цель» того же метода сбора данных HS-MRM нажмите на значения по умолчанию и введите 0,1, один, 10 и 100 наномоляров для всех компонентов искусственного пептида. После ввода первого значения щелкните правой кнопкой мыши и выберите опцию заполнения, чтобы ввести одинаковую концентрацию для всех компонентов. Повторите ту же процедуру для всех четырех концентраций калибровочной кривой.

Теперь перейдите на вкладку обработки и нажмите на настройки извлечения. Введите 10 ppm для допуска по массе. Затем нажмите на CCS drift time tolerance и введите 5% для допуска CCS.

Во вкладке обработки выберите настройки пиковой обработки. В разделе сглаживания выберите среднее значение в качестве алгоритма сглаживания, одно — в качестве половины ширины и одно — в качестве итераций. В разделе интеграции убедитесь, что отмечены параметры автоматической ширины пика и автоматического обнаружения.

Далее на вкладке обработки выбираем целевые настройки экрана, а в окне RT выбираем вариант ближайшего к RT. Затем введите 0,2 минуты для допуска по времени хранения. Выберите настройки количественной оценки и в меню калибровки выберите линейный для типа подгонки калибровочной кривой, один над x в квадрате для типа веса, концентрацию для типа компонента, миллимоли на литр для единиц измерения стоимости компонента и нет для вычисления точек калибровки путем усреднения.

В меню количественной оценки выберите область в качестве значения ответа. Примеры хроматограмм HS-MRM, сгенерированных для искусственных пептидов во всех концентрациях, представлены здесь. Здесь отображаются калибровочные кривые, полученные для каждого пептида после интегрирования пиков HS-MRM.

Здесь обобщено относительное стандартное отклонение площади пика, рассчитанное на основе четырех инжекций репликатов. Поскольку высокоселективный MRM-анализ включает в себя как разделение предшественников ионной подвижности, так и целенаправленное масс-спектрометрическое детектирование с высоким разрешением, он имеет большой потенциал для быстрого и высокопроизводительного анализа мониторинга нескольких белков клетки-хозяина в партиях биофармацевтических препаратов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как настроить высокоселективный MRM-анализ на приборе Vion IMS QTof.