Простая камера для долговременной конфокальной визуализации развития корней и гипокотилов

Общая цель этой системы визуализации заключается в использовании конфокальной флуоресцентной микроскопии для наблюдения за развитием органов растений в течение нескольких дней с субклеточным разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы морфогенеза растений, например, как клетки многоклеточных организмов координируют свои модели роста и пролиферации во время органогенеза? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он прост в настройке и не требует специального оборудования, часто используемого для покадровой визуализации, такого как системы Profusion.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы прочитали публикацию Литтлджона и Лава в журнале New Phytologist, в которой описываются преимущества перфтордекалина для визуализации в тканях листьев. Для начала с помощью стеклореза сделайте стеклянные полоски шириной три миллиметра из предметного стекла толщиной в один миллиметр. Затем с помощью цианоакрилатного клея или двустороннего скотча закрепите полоски на расстоянии примерно 45 миллиметров друг от друга по ширине нового предметного стекла.

Сделайте дополнительную горку тех же размеров, которая будет служить формой. Теперь изготовьте прокладку такой же высоты из газопроницаемой камеди PDMS. Смочите второе предметное стекло небольшим количеством абсолютного этанола и расправьте PDMS на предметном стекле до высоты стеклянных полос.

Затем смочите лезвие абсолютным этанолом и обрежьте излишки PDMS. Это очень важно, так как инструменты, смоченные в этаноле, не будут прилипать к PDMS. Затем распрямите PDMS до высоты полосы.

Затем вырежьте полость в PDMS, которая будет удерживать саженец и агаровую плиту. Чтобы получить полость постоянного размера, мы используем сделанный на заказ самодельный резак, изготовленный из специальных спецификаций, но вместо него можно использовать бритвенное лезвие. Далее обрежьте по внешнему краю, чтобы сделать прокладку толщиной около двух миллиметров.

Теперь на предметное стекло без прокладки PDMS положите покровное стекло на обе стеклянные полосы. Затем в пространство под покровным стеклом внесите пипеткой около одного миллилитра теплой сжиженной агаровой среды, достаточной для заполнения пространства. Агар может содержать экспериментальные соединения, представляющие интерес.

Затем уравновесьте некоторое количество PFD в воздухе, встряхивая небольшой объем PFD в трубке. Как только агар схватится, загрузите примерно 200 микролитров PFD в прокладку PDMS, но не заполняйте ее полностью. Снимите покровное стекло с агаровой плиты, и разрежьте его по форме, которая будет подходить к колодцу гелевой прокладки PDMS.

Оставьте зазор в два-четыре миллиметра между агаром и стенкой прокладки. Затем полностью заполните камеру уравновешенным воздухом PFD. Для визуализации гравитропных первичных корней целлюлозная мембрана используется в качестве физического барьера на поверхности агаровой плиты.

Агаровая плита также должна быть мягче с 0,8% агара, а не 1,5% агара. Отрежьте кусок мембраны, который имеет примерно такие же размеры, как агаровый блок. Затем простерилизуйте его 80% этанолом и дайте высохнуть на воздухе.

После высыхания замочите мембрану в жидкой питательной среде, а затем перенесите ее на поверхность агара. Для начала аккуратно поместите на агар до трех саженцев. Их позиционирование имеет решающее значение.

Семядоли и гипокотиль должны свисать над краем агара, плавая в PFD. Между сеянцами должно быть предусмотрено пространство для роста. Рассаду можно скручивать, если она слишком велика, чтобы поместиться в камеру.

Затем закройте камеру с помощью покровного стекла толщиной в соответствии с выбранной целью. Осторожно надавите по краю, чтобы произошел контакт со стеклянными полосками. С помощью другого предметного стекла аккуратно прижмите покровное стекло так, чтобы оно равномерно легло на две стеклянные полоски.

Затем закрепите покровное стекло с помощью микропористой хирургической ленты, разрезанной пополам вдоль. Теперь дайте образцу отстояться примерно на полчаса перед визуализацией. Чтобы подготовить рассаду арабидопсиса талиана к камерам, сначала простерилизуйте семена с 70% этанолом.

А затем посадите их на подкормленную среду. Посаженные семена стратифицируют в течение двух-четырех дней при четырех градусах Цельсия. Затем перенесите посаженные семена при температуре 22 градуса Цельсия и выращивайте их вертикально ориентированными при 16-часовом ежедневном световом цикле.

Чтобы получить изображение боковых корней, выращивайте растения в течение 7-10 дней, а затем перенесите их в камеры визуализации. Боковые корни, растущие с физиологической скоростью в камерах визуализации, регистрировались каждые полчаса. Боковые корни также выращивали на стандартных пластинах Петри в той же среде для сравнения.

Скорость роста отдельных корней сильно варьировалась в обоих вариантах, но диапазон был одинаковым в обоих условиях. В целом, скорость роста увеличивалась с увеличением длины. Скорость роста растений в камерах визуализации или на планшетах была неразличима в течение первых 27 часов роста.

Обе группы начинали с одинаковой средней длины бокового корня. Боковые корни, коэкспрессирующие маркер плазматической мембраны и маркер микроканальцев, визуализировались с интервалом в один час в камерах визуализации. Корни были очень стабильны в своих положениях, что позволяло проводить конфокальную визуализацию в течение нескольких часов.

Визуальные индикаторы пролиферации наблюдались на протяжении всего эксперимента. В меристемных клетках можно было идентифицировать префазные полосы, митотические веретена и фрагмопласты. В течение трех дней рост боковых корней существенно не отличался в камерах визуализации по сравнению с планшетами Петри в течение первых 48 часов, но к 72 часам средняя скорость роста снизилась.

Тем не менее, значительная часть корней в камерах все еще росла со скоростью, сопоставимой с корнями на пластинах в течение 72 часов. После освоения можно сделать два слайда за 15 минут, если все пройдет гладко. Эту систему визуализации можно использовать для изучения эффекта фармакологического лечения, хотя для экспериментов по вымыванию требуются и другие, более сложные методы, такие как перфузионные системы.

После своего развития этот метод предоставил дешевые и простые средства для отслеживания клеточных событий, лежащих в основе морфогенеза растений, в частности, для изучения роли клеточных границ, пространственных требований, разделяющих органогенез в боковых корнях arabidopsis thaliana.