In Vivo Отслеживание развития отек и микрососудистая патология в модели экспериментальной церебральной малярии с использованием магнитно-резонансной томографии
8 июня 2017 г.
Мы описываем мышиную модель экспериментальной церебральной малярии и показываем, как воспалительную и микрососудистую патологию можно отслеживать in vivo с помощью магнитно-резонансной томографии.
Общей целью данного метода является мониторинг патологических изменений экспериментальной церебральной малярии in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы патогенеза экспериментальной церебральной малярии, так как позволяет визуализировать in vivo, как патология всего мозга развивается в пространстве и во времени. Таким образом, этот метод позволяет детально оценить патологию головного мозга и может быть использован для оценки эффективности новых стратегий лечения церебральной малярии.
Настройку МРТ будет выполнять Мануэль Фишер, руководитель нашей лаборатории. Начните со сбора самок комаров из клетки через 17-22 дня после приема пищи кровью. С помощью щипцов поместите три-четыре комара на предметное стекло в сочетании с каплей холодной среды RPMI.
Затем поместите предметное стекло под микроскоп. Осторожно растяните комара между головой и телом с помощью щипцов, а с помощью шприца и иглы изолируйте слюнную железу. Далее соберите слюнные железы со предметного стекла, всасыв их стеклянной пипеткой, и перенесите в центрифугу объемом 1,5 миллилитров
.Затем с помощью небольшой пластиковой палочки раздавите изолированные слюнные железы в центрифужной пробирке в течение трех минут, чтобы изолировать спорозоиты от ткани слюнных желез. Центрифугируйте в течение трех минут при 1000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия, чтобы очистить спорозоиты от оставшейся ткани. Пипеткой надосадочная жидкость, содержащая спорозоиты, подается в новую центрифужную пробирку и подсчитываются очищенные спорозоиты в гемоцитометре Нейбауэра.
Спорозоиты демонстрируют типичное движение против часовой стрелки. Затем отрегулируйте концентрацию очищенных спорозоитов до 10 000 на миллилитр, добавив фосфатно-солевой буфер. Наконец, поместите мышь C57BL/6 в ограничитель и опустите ее хвост в теплую воду, чтобы лучше визуализировать хвостовую вену.
Затем введите в общей сложности 1000 спорозоитов, или 0,1 миллилитра, в хвостовую вену, чтобы инициировать инфекцию. Начните с того, что поднесите мышь к магнитно-резонансной томографии для мелких животных 9,4 Тл, или МРТ-сканеру, который использует объемный резонатор для радиочастотной передачи. Затем нанесите глазную мазь с декспантенолом на оба глаза.
Включите водяную баню с регулируемой температурой до 42 градусов по Цельсию для того, чтобы поддерживать температуру тела мыши. Затем поместите катетер для хвостовой вены мыши в хвостовую вену мыши. Затем расположите мышь для МРТ, положив ее лежа и со сжатой спиной на кровать для животных, оборудованную фиксатором головы и зубчатым стержнем, чтобы свести к минимуму движение головы.
Следите за тем, чтобы не выпрямить шейный отдел позвоночника мыши. Подсоедините к катетеру хвостовой вены систему введения контрастного вещества, заполненную 0,3 миллимоль на килограмм Gd-DTPA. Затем поместите катушку 4-канального поверхностного приемника с фазированной антенной решеткой на головку мыши.
Наконец, поместите дыхательную подушку на заднюю часть мыши и проверьте дыхание на устройстве мониторинга. Включите позиционный лазер, нажав F2 на панели управления, и перемещайте мышь до тех пор, пока горизонтальный позиционный свет не окажется в середине меньшей части катушки, которая покрывает головку мыши. Выключите позиционный лазер, нажав F2 еще раз, а затем переместите мышь в конечное положение, нажав F3 на панели управления.
Начните с выполнения локализующего сканирования, чтобы убедиться, что мозг мыши находится в изоцентре магнита. Качественная оценка вазогенного отека с помощью 3D Т2-взвешенной визуализации. Выберите многосрезовую последовательность RARE и отрегулируйте положение среза, убедившись, что весь мозг, от носа до мозжечка, покрыт.
После настройки срезов насыщенности запустите последовательность и подождите 10 минут и 48 секунд, чтобы получить изображения. Затем проведите Т2-релаксометрию для количественной оценки вазогенного отека путем выбора многосрезовой эхо-последовательности с несколькими спинами. Отрегулируйте положение среза и начните сбор последовательности, который занимает восемь минут и 53 секунды.
Чтобы количественно оценить как вазогенный отек, так и цитотоксический отек, проведите диффузионно-взвешенную визуализацию путем выбора спин-эхо-диффузионной последовательности EPI. Отрегулируйте положение среза и срез насыщенности. Затем запустите последовательность и подождите семь минут и 56 секунд, пока не будут получены необработанные изображения.
После этого оцените микрокровоизлияния с помощью 3D T2 звездовзвешенной визуализации. Выберите последовательность FLASH с компенсацией потока, отрегулируйте положение среза и запустите последовательность, которая длится 15 минут 40 секунд. После этого оцените проходимость артерий с помощью времяпролетной ангиографии, выбрав последовательность 3D FLASH.
Отрегулируйте положение среза, запустите последовательность и подождите семь минут и 16 секунд, пока изображения не будут получены. Наконец, оцените нарушение гематоэнцефалического барьера. Выберите взвешенное по шкале 3D T1 изображение с последовательностью FLASH, отрегулируйте положение среза и запустите последовательность.
Подождите одну минуту и 14 секунд, пока не будут получены изображения без контраста. Затем введите контраст 0,3 миллимоль на килограмм и повторите измерение. Увеличение нарушения гематоэнцефалического барьера и увеличение жидкости указывают на ранний вазогенный отек обонятельной луковицы, который уже присутствует при легком заболевании и начинает распространяться в сторону ствола мозга по мере увеличения тяжести заболевания.
На картах Т2 тяжесть вазогенного отека может быть количественно определена путем наложения областей интереса на конкретные анатомические области. Для каждой области может быть получено время релаксации Т2, которое увеличивается с увеличением отека. Кроме того, объем мозга, указывающий на отек, начинает значительно увеличиваться у умеренно больных мышей по сравнению с исходным уровнем, и еще больше увеличивается у тяжелобольных мышей.
Наконец, микрососудистая патология, о чем свидетельствуют микрокровоизлияния и повышение контраста восприимчивости сосудов, возникает после появления первых признаков нарушения гематоэнцефалического барьера при вазогенных отеках. Эти микрокровоизлияния преимущественно происходят в обонятельной луковице. Если получен полный протокол МРТ, все изображения, включая позиционирование, могут быть получены в течение одного часа, если он выполнен правильно.
Минимальный протокол должен включать Т2-взвешенную последовательность или Т2-релаксометрию, а также Т2-взвешенную звездообразную последовательность для оценки наличия вазогенного отека, микрогеморхагальной нагрузки и микрососудистых нарушений. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как МРТ всего мозга визуализирует патологические изменения при экспериментальной церебральной малярии, включая такие изменения, как отек мозга, который трудно обнаружить ex vivo.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается мышиная модель экспериментальной церебральной малярии и демонстрируется возможность отслеживания воспалительной и микрососудистой патологии in vivo с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Данный метод позволяет визуализировать патологию головного мозга в динамике, что способствует пониманию прогрессирования заболевания и эффективности лечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Инфекционные заболевания
- Методы визуализации
Теоретическая часть
- Экспериментальная церебральная малярия представляет собой тяжелое осложнение малярии.
- Понимание ее патогенеза имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения.
- Методы визуализации in vivo позволяют получить представление о прогрессировании заболевания.
- Магнитно-резонансная томография (МРТ) является неинвазивным методом оценки патологии головного мозга.
Цель исследования
- Для мониторинга патологических изменений при экспериментальной церебральной малярии.
- Для визуализации динамики развития патологии головного мозга в пространстве и времени.
- Для оценки эффективности новых стратегий лечения.
Используемые методы
- Мышиная модель экспериментальной церебральной малярии.
- Магнитно-резонансная томография (МРТ) для отслеживания in vivo.
- Оценка воспалительной и микрососудистой патологии.
- Сбор самок комаров для экспериментальной установки.
Основные результаты
- Успешное отслеживание патологий головного мозга с помощью МРТ.
- Визуализация воспалительных реакций в головном мозге.
- Представления о пространственной и временной эволюции заболевания.
- Потенциальное применение для оценки эффективности лечения.
Выводы
- Данное исследование предоставляет ценный инструмент для понимания механизмов церебральной малярии.
- Визуализация in vivo может улучшить оценку стратегий лечения.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения терапевтических вмешательств.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет осуществлять неинвазивный лонгитюдный мониторинг нарушения гематоэнцефалического барьера, отека и микрососудистой патологии на трансляционной модели церебральной малярии. Предоставляя количественные данные МРТ о прогрессировании заболевания, этот подход способствует механистическому снижению рисков при изучении нейровоспалительных путей и прогностической оценке терапевтических средств, воздействующих на ЦНС. Данный метод улучшает валидацию мишеней, связывая сосудистые и воспалительные механизмы с измеримыми визуализационными биомаркерами in vivo.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем визуализации пространственной и временной эволюции нарушения гематоэнцефалического барьера и отека in vivo.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней, участвующих в нейровоспалении и микрососудистой патологии, с помощью лонгитюдной визуализации.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля препаратов путем количественной оценки развития отека и степени микрокровоизлияний как транслируемых биомаркеров тяжести заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных систем, релевантных конкретному заболеванию, для последующего скрининга путем установления базовых МРТ-фенотипов вазогенного и цитотоксического отека.
- Количественные показатели: Определение времени Т2-релаксации и измерение объема мозга, что позволяет проводить стандартизированную и воспроизводимая оценку отека в различных группах лечения.
- Повторное использование платформы: Создание масштабируемой платформы визуализации для оценки влияния соединений на целостность гематоэнцефалического барьера и микрососудистую патологию в моделях заболеваний ЦНС.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: Моделирует ключевые особенности церебральной малярии у людей, включая отек, отек головного мозга и микрососудистую патологию, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая преемственность: Обеспечивает связь между этапом поиска и преклинической валидацией, позволяя осуществлять неинвазивное отслеживание патологии от ранних до тяжелых стадий заболевания.
- Принятие решений с учетом рисков: Помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшего продолжения исследований (go/no-go) путем корреляции показателей отека и микрокровоизлияний, полученных с помощью МРТ, с неврологическим дефицитом и показателями выживаемости.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки лекарств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, обеспечивая получение конечных точек на основе визуализации, которые отражают функцию гематоэнцефалического барьера и состояние нейроваскулярного здоровья.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о сосудистых и воспалительных механизмах за счет визуализации эволюции патологии во всем мозге в пространстве и времени.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа благодаря стандартизированным протоколам МРТ, которые количественно определяют выраженность отека и микроизлияний для надежного скрининга соединений.
- Аналитика: генерирует количественные данные T2-релаксометрии, диффузионно-взвешенных и Т2*-взвешенных изображений, что упрощает межгрупповое сравнение и моделирование зависимости «доза-эффект».
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь с доклинической валидацией путем мониторинга патологических изменений, имеющих значение для заболевания и отражающих проявления церебральной малярии у людей.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемый инструмент в программах по инфекционным заболеваниям ЦНС, нейровоспалению и проникновению через гематоэнцефалический барьер.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в отношении нейроваскулярного и воспалительного вклада в патологию.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря унифицированным протоколам сбора данных МРТ и последующей обработки для количественной оценки отека и микроизлияний.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя транслируемые биомаркеры визуализации, которые снижают риск неудач на поздних стадиях разработки препаратов для ЦНС.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков путем связывания показателей отека и микроизлияний, полученных с помощью МРТ, с тяжестью заболевания и ответом на лечение.
Рекомендации по внедрению
- Требуется экспертный опыт в области МРТ мелких животных, работы с контрастными веществами, а также в нейропатологической интерпретации отека и микрососудистых изменений.
- Зависит от наличия высокопольного МРТ-оборудования (9.4T), объемных резонаторов, фазированных антенных решеток и систем введения контраста для подачи Gd-DTPA.
- Необходима стандартизация взаимодействия между группами паразитологов, специалистов по визуализации и патологоанатомов для обеспечения единообразия моделей инфекции и анализа изображений.
- Требует учета особенностей адаптации при применении модели к другим линиям, видам или патологиям ЦНС, помимо экспериментальной церебральной малярии.
- Ограничено технической сложностью протоколов МРТ с использованием нескольких последовательностей и необходимостью точного физиологического мониторинга во время сканирования.
