Моделирование рака яичников Многоклеточная Сфероид Поведение в микроустройство Dynamic 3D перитонеального

Общая цель этой процедуры заключается в создании динамической платформы совместного культивирования на основе микрофлюидов для имитации внутрибрюшинной среды с клеточными и механическими компонентами, где происходит метастазирование рака яичников. Используя этот микро для этой платформы, он помогает ответить на ключевые вопросы в области биологии рака, такие как микроокружение перитонеальной диссеминации. Основное преимущество этого метода заключается в том, что 3D-кокультура при точно контролируемом свободном потоке лучше имитирует in vivo коммуникацию между раковыми клетками яичников и клетками метотедии, которая происходит в брюшной полости.

После проектирования и рисования микрофлюидного канала и его изготовления в соответствии с текстовым протоколом нанесите SU82075 слой фоторезиста на силиконовую пластину со скоростью вращения 1800 об/мин. Выпекайте пластину с фоторезистным покрытием непосредственно на горячей плите при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут. А затем при 95 градусах Цельсия в течение 25 минут удалить излишки растворителя.

Нанесите на пластину второй слой фоторезиста SU82075 до конечной толщины 250 микрометров. Поместите пластину с фоторезистным покрытием непосредственно на горячую плиту при температуре 65 градусов Цельсия на семь минут, а затем при температуре 95 градусов Цельсия на 30 минут, а затем медленно охладите пластину до комнатной температуры. Далее выровняйте и положите фотомаску прямо поверх.

Затем подвергните его воздействию ультрафиолетового света в течение 20 секунд, чтобы пересечь длину узора. На горячей плите выпекайте покрытую покрытием при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут и при температуре 95 градусов Цельсия в течение 12 минут, чтобы удалить растворитель для предварительной лимеризации. Извлеките фоторезист непоперечной длины, погрузив пластину в проявитель SU8 на 25 минут.

Затем с помощью изопропанала промойте и используйте сжатый воздух для ее сушки. Смешайте основание полидиметилсилоксана или PDMS и отвердитель в соотношении масс 10 к одному и используйте центробежный смеситель с функцией смешивания и дегазации для смешивания раствора. Медленно вылейте смесь PDMS на пластину на высоту примерно пяти миллиметров.

Дегазируйте PDMS в вакуумном эксикаторе в течение 40 минут. Затем высушите PDMS в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух часов. Аккуратно снимите плиту PDMS с мастера и обрежьте PDMS по каналам до размера предметного стекла.

Затем с помощью одномиллиметрового биопсийного перфоратора пробейте PDMS, чтобы создать входные и выходные отверстия устройства. Используйте сжатый воздух для очистки поверхности PDMS, а затем с помощью клейкой ленты удалите пыль и мусор PDMS. Теперь поместите плиту PDMS стороной канала вверх в плазменный очиститель.

Затем поместите чистое предметное стекло в плазменный очиститель рядом с плитой PDMS. Обработайте PDMS и предметное стекло под воздушную плазму на высоком радиочастотном или радиочастотном уровне в течение одной минуты. Затем, после извлечения образцов из плазменного очистителя, привяжите PDMS к предметному стеклу для создания необратимой ковалентной связи.

Поместите чип PDMS на горячую плиту при температуре 150 градусов Цельсия на один час, чтобы повысить прочность сцепления и вернуть гидрофобность PDMS перед использованием. Чтобы покрыть микрофлюидные каналы фибронектином, начните с использования 30 микролитров 75% этанола для стерилизации каналов. Удалите этанол и дважды промывайте каналы с помощью PBS.

Затем тщательно отсасывайте PBS из каналов. Приготовьте 10 мкг на миллилитр раствора фибронектина в бессывороточной M199MCDB105 среде с 30 микролитрами раствора, медленно заполните каналы и заклейте их скотчем с помощью скотча. Затем инкубируйте чип при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.

Чтобы засеять первичные клетки перитонеального мезотелия или ГПМЦ в микрофлюидные каналы, после промывки культивируемых клеток согласно текстовому протоколу используют два миллилитра 10%-ной питательной среды FBS для повторного суспендирования ГПМЦ. С помощью гемоцитометра подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию клеток до 3,5 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр. Нагрейте микрофлюидный чип, покрытый фибронектином, в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение пяти минут перед использованием.

Затем полностью отсасывайте раствор фибронектина и медленно пипетируйте по 30 микролитров суспензии ГПМЦ в каждый канал. Используйте скотч для герметизации каналов и поместите устройство в CO2-инкубатор на ночь. Чтобы вызвать образование сфероидов при раке яичников, растворите 0,5%агарозу в стерилизованной воде.

Раздайте 50 микролитров раствора агарозы в лунки 96 луночных планшетов. После подсчета ранее культивированных клеток эпителиального рака человека повторно суспендируют клетки в культуральной среде 5% FBS при плотности 5000 клеток на миллилитр. Перелейте по 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку, покрытую агарозой.

И культивируйте клетки при 37 градусах Цельсия и пяти процентах CO2 в течение 48 часов. Перенесите раковые сфероиды в 50-миллилитровую центрифужную пробирку, предварительно смоченную одним миллилитром бессывороточной среды, и вращайте сфероиды в 750 раз G в течение пяти минут. После приготовления 2,5 мкг на миллилитр раствора CMFDA в бессывороточной M199MCDB105 среде.

Повторно суспендируйте раковые сфероиды в одном миллилитре раствора и инкубируйте сфероиды при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем подсчитайте сфероидное число и с помощью бессывороточной среды отрегулируйте концентрацию до 2000 сфероидов на миллилитр. Перед загрузкой сфероида медленно введите 100 микролитров M199MCDB105 среды, не содержащей сыворотки, чтобы смыть неадгезионные клетки внутри каналов.

Загрузите по 30 микролитров суспензии сфероидов с флуоресцентной меткой в каждый канал. Затем поместите микрофлюидный чип в CO2-инкубатор. Соберите платформу для изобилия, прикрепив шприц со свежей M199MCDB105 средой без сыворотки к пробирке длиной один метр.

Поместите шприц на шприцевой насос и закрепите поршень и корпус шприца. Затем установите шприцевой насос в горизонтальное положение на той же высоте, что и микрофлюидный чип внутри инкубатора. Быстро наполните всю трубку средой, нажав и удерживая кнопку быстрой перемотки вперед, пока среда не переполнится в трубке.

Затем запустите впрыск с желаемой скоростью потока. Подсоедините трубку к входу в канал согласно текстовому протоколу. Затем с помощью трубки с коротким выходом соедините выходное отверстие канала с 50-миллилитровой конической трубкой для сбора исходящей среды.

Наконец, используйте светлопольный или флуоресцентный микроскоп для наблюдения за HPMC и раковыми сфероидами. С помощью микрофлюидной платформы, описанной в этом видео, сфероиды рака яичников были смоделированы с мезотелиальными клетками в гидродинамических условиях. Как показано на этом рисунке, мезотелиальные клетки, которые культивировались в микроустройстве в течение 16 часов, успешно образовали монослой ГПМЦ.

В этом эксперименте многоклеточные сфероиды диаметром около 100 микрометров, которые по размеру аналогичны тем, которые были обнаружены в обществах пациентов, были помечены зеленым флуоресцентным красителем CMFDA. Затем сфероиды переносили в микрофлюидные каналы, покрытые ГПМЦ, и оставались в суспензии, а морфология клеток захватывалась. После освоения этой техники ее можно выполнить за несколько часов в течение трех дней, если она выполнена правильно.

В одном из 10 случаев при этой процедуре важно помнить о том, что следует избегать введения пузырьков воздуха в микрофлюидные каналы. После этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как медикаментозное лечение, анализы адгезии, анализы мезотелиии и клиренса, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние интроперитонеального микроокружения на прогрессирование рака. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии рака к изучению перитонеального местастастиса у человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать перитонеальное микроустройство с жидкостным потоком для запуска поведения рака яичников в брюшной полости. Не забывайте, что работа с органическими серами, такими как ацетон, в качестве проявителя и цилина может быть крайне опасной. При первом выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности при первом выполнении этой процедуры.

Все процедуры, связанные с этим офисом, должны выполняться в условиях крайней тайны.