Лечение связочных конструкций с помощью сыворотки, обусловленной упражнениями: модель трансляционной тканевой инженерии

Общая цель этой модели — определить влияние физических упражнений и питания на синтез и функцию соединительной ткани. В этом методе используется человеческая сыворотка, которая принимается до и после тренировки для лечения трехмерных тканей, чтобы мы могли понять, как физические упражнения влияют на функцию связок и сухожилий. 3D-обеспечение тканей сочетает в себе преимущества хорошо охарактеризованных тестов in vitro с функцией, морфологией и биохимическими характеристиками тканей in vivo.

Предварительно подготовив 35-миллиметровые пластины с силиконовым покрытием в соответствии с текстовым протоколом, подготовьте анкерные формы, поместив по одному мельчайшему штифту в центр каждой цилиндрической лунки в формах. Смешайте бета-трикальцийфосфат и раствор ортофосфорной лимонной кислоты в концентрации от одного до трех граммов на миллилитр в пластиковой лодке для взвешивания на льду. Используйте скребок для пластиковых ячеек, чтобы энергично перемешать цемент.

Измельчите цемент, чтобы продолжить перемешивание, и разложите смесь пипеткой по формам, затем центрифугируйте заполненную форму при 2, 250 г в течение пяти минут. После центрифугирования дайте цементным анкерам застыть при комнатной температуре на ночь. На следующее утро извлеките анкеры из формы и приколите два анкера на расстоянии 12 миллиметров друг от друга в каждой пластине с силиконовым покрытием.

Простерилизуйте прикрепленные пластины, распылив на них 70% этанола, заполнив пластины и крышки, затем поместите пластины в шкаф биологической безопасности или BSC. По прошествии не менее 30 минут аспирируйте пластины и дайте им попробовать в BSC. Установите крышки на место и храните их в ДСК до тех пор, пока они не понадобятся.

Соблюдение местных правил биологической опасности для надлежащего использования и утилизации биологически опасных материалов. Поддерживайте стерильность и выполняйте этапы формирования конструкций в шкафу биологической безопасности. После подготовки первичных фибробластов, реагентов и пластин с силиконовым покрытием с закрепленными якорями брашитов, согласно текстовому протоколу, культивируют клетки в 15-сантиметровых пластинах до 70% слияния.

Затем приготовьте мастер-смесь, состоящую из следующих компонентов: 681 микролитр на конструкцию клеточной суспензии, 29 микролитров на конструкцию тромбина, два микролитра на конструкцию апротинина и два микролитра на конструкцию аминогексановой кислоты. Хорошо перемешав раствор, добавьте 714 микролитров в каждую штифтовую пластину в виде восьмерки вокруг цементных анкеров брашита, следя за тем, чтобы основная смесь непосредственно контактировала со сторонами анкеров. Аккуратно постучите по каждой тарелке, чтобы равномерно распределить смесь.

Наиболее важным этапом является формирование фибринового геля, сидящего в клетках. Убедитесь, что мастер-смесь для сидения в камере непосредственно контактирует с анкерами, и постучите по пластине, чтобы равномерно распределить смесь. По одной пластине за раз добавляйте 286 микролитров фибриногена по каплям равномерно на тарелку.

Немедленно сдвиньте пластину вперед и назад и из стороны в сторону, чтобы распределить фибриноген и сформировать встроенные в клетки фибриновые гели, затем перейдите к следующей пластине. Поместите конструкции в стерильный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и инкубируйте их не менее 15 минут, чтобы обеспечить полимеризацию фибриногена. Приготовьте два миллилитра на конструкцию кормовой среды, добавив питательную среду 200 микромоль аскорбиновой кислоты, 50 микромоль пролена и пять нанограммов на миллилитр TGF бета 1.

Используйте два миллилитра кормовой среды, чтобы покрыть каждую конструкцию, и культивируйте конструкции в стерильном инкубаторе, поддерживаемом при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в общей сложности 14 дней или до желаемой конечной точки, обновляя среду каждые два дня двумя миллилитрами кормовой среды. Чтобы собрать человеческую сыворотку, возьмите образец крови в состоянии покоя в соответствии с текстовым протоколом, затем попросите участников выполнить режим упражнений, который соответствует вашей цели исследования. Здесь показана 30-минутная тренировка с высокоинтенсивными отягощениями.

Соберите образец крови через 15 минут после тренировки, затем, дав крови свернуться, вращайте образец со скоростью 1500 г в течение 10 минут. В стерильных условиях переложите сыворотку в стерильные пробирки для приготовления среды. После подготовки конструкций связок проведите испытание на растяжение с помощью тестера на растяжение в ванне PBS с обратными формованными захватами, которые соединены с преобразователем силы.

Это удерживает цементные анкеры на месте во время испытания. С помощью цифровых штангенциркулей определите длину и конструкцию связки, а также рассчитайте площадь поперечного сечения ткани. Отсоедините конструкцию связки от пластины и поместите анкеры в обратные формованные захваты, убедившись, что конструкция погружена в PBS, затем отрегулируйте расстояние между захватами, установив длину конструкции на ее начальную длину.

Начните испытание и напрягите конструкцию до разрушения со скоростью 0,4 миллиметра в секунду, или 3% в секунду. После теста обработайте ткань и проведите количественное определение коллагена в сконструированных связках в соответствии с текстовым протоколом. После одного-двух дней в культуре фибробласты передней крестообразной связки прикрепляются к фибриновому гелю, расширяют клеточные процессы и начинают оказывать тяговые силы.

Между двумя опорными точками создается напряжение, и клетки выравниваются параллельно этой оси и начинают откладывать коллаген. Здесь показан репрезентативный график деформации напряжения для связки, испытанной на разрушение. В этих экспериментах человеческая сыворотка была выделена из образцов крови до и после тренировки и использовалась вместо FBS для создания среды, обогащенной биохимической средой, вызванной физической нагрузкой.

Как показано на этом графике, после 14-дневного периода культивирования конструкции связок продемонстрировали значительное увеличение как максимальной нагрузки на растяжение, так и содержания коллагена в ответ на сыворотку после тренировки. После освоения конструкции связок могут быть изготовлены в течение двух дней, а через две недели они будут готовы к испытаниям на растяжение, количественному определению содержания коллагена и другим биохимическим анализам. Эта трансляционная модель in vitro in vivo является частью более широкой миссии по пониманию того, как физические упражнения улучшают функцию связок, сухожилий и, фактически, почти каждой ткани в организме.

Таким образом, это действительно надежный и сильный метод, с помощью которого мы можем определить содержание коллагена и функцию соединительной ткани после лечения с помощью физических упражнений, питания, нагрузки, любых типов факторов роста, всех видов различных вмешательств, которые мы можем проводить у людей или животных.