Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах
5 мая 2017 г.
Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы позволить исследователям захватывать, разделять и анализировать нативные белковые комплексы, извлеченные из тканевых лизатов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Этот метод может помочь исследователям, изучающим белки, потому что он способен стабилизировать лабильные белковые ассоциации в условиях, близких к нативным, что позволяет идентифицировать их и последующий анализ. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она использует общие биологические методы, поэтому она широко применима и может быть адаптирована к целям отдельного исследователя.
Чтобы начать эту процедуру, подготовьтесь к электрофорезу в нативном полиакриламиде как описано в текстовом протоколе. Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте белки в геле при напряжении 150 вольт, пока полоса красителя не продвинется примерно на два сантиметра в разрешающий слой. В этот момент остановитесь и отключите электропитание.
После разборки аппарата электрофореза отделите стекла гелевой кассеты. Снимите и выбросьте слой укладки. Аккуратно разрежьте гель чуть ниже нижнего края лицевой стороны красителя, стараясь сделать этот срез как можно более гладким и прямым.
Затем выбросьте неиспользованный кусочек геля. Обрежьте все неиспользованные участки по краям гелевой полоски. Осторожно поместите полоску в 10 миллилитров буферизованного физраствора фософата в небольшую емкость и аккуратно перемешайте в течение 30 минут для уравновешивания.
После уравновешивания выбросьте и замените PBS еще на 10 миллилитров. Пипеткой 500 мкл 25 миллимолярного ДСП растворить в диметилсульфоксиде в ПБС и продолжить перемешивание, как и раньше, в течение 30 минут. Через 30 минут слейте раствор DSP.
В 10 мл 0,375 моляра HSCL, pH 8,8, содержащий 2% додецилсульфата натрия для гашения непрореагировавшего DSP. Продолжайте записывать в течение 15 минут. Пока происходит закалка гелевой полоски, приготовьте растворы геля SDS-PAGE по стандартным методам.
Не добавляйте реагенты для полимеризации. После закалки верните синюю родную гелевую полоску до комнатной температуры и залите полоску в новую гелевую кассету. Для этого аккуратно поднимите гель и поместите его на чистую гелевую кассетную распорную пластину.
Сориентируйте полосу так, чтобы она была перевернута от своей предыдущей ориентации, а нижняя часть лицевой стороны красителя была ближе всего к верхней части новой кассеты. Расположите полосу так, чтобы ее верхний край лежал на одном уровне с тем местом, где будет верхний край накладки. Убедитесь, что лицевая сторона красителя параллельна горизонтальным краям стеклянной пластины.
Прижмите одну сторону вырезанной полосы к одной из стенок распорки, оставив место с другой стороны для заливки геля и загрузки стандарта белка или лестницы. Если нижний край гелевой полоски содержит какие-либо неровные или неровные участки, аккуратно срежьте их. После того, как гелевая полоска будет правильно размещена, наложите накладку на распорную пластину.
Слегка надавите, чтобы вытолкнуть все захваченные пузырьки воздуха. Продолжайте собирать аппарат для заливки геля в соответствии с инструкциями производителя. Гелевая полоска иногда смещается при установке верхней пластины.
Это помогает позволить полосе немного свисать над краем верхней пластины, чтобы ее можно было отрегулировать с помощью шпателя для коррекции любых смещений. Добавьте реагенты полимеризации в растворяющий гелевый буфер и залейте его в подготовленную гелевую кассету с помощью серологической пипетки. Заполните гелевую кассету примерно на два сантиметра ниже иссеченной синей нативной гелевой полоски PAGE, чтобы освободить место для слоя укладки.
Затем добавьте 100 микролитров бутанола поверх залитого геля и дайте 30 минут для полимеризации разрешающего слоя, прежде чем вылить бутанол. Далее добавьте реагенты полимеризации в раствор укладывающего геля. С помощью серологической пипетки налейте слой укладки, чтобы заполнить все оставшееся пустое место в гелевой кассете.
Наклоните гелевую кассету во время заливки слоя укладки, чтобы она заполнила пространство под полоской геля и пузырьки воздуха не задерживались. По мере того как буфер для укладки геля заполняет пустое пространство под полоской геля, постепенно возвращайте кассету с гелем на ровное положение. Продолжайте заполнять пустое пространство рядом с иссеченной гелевой полоской с помощью стеклирующего гелевого буфера, пока он почти не переполнится.
Затем дайте слою для укладки полимеризоваться в течение 30 минут. После того, как слой укладки полимеризуется, извлеките гелевую кассету из разливочного аппарата, промойте ее дистиллированной водой и соберите аппарат электрофореза в соответствии с инструкциями производителя. Полностью заполните внутреннюю камеру 1x рабочим буфером SDS-PAGE.
Затем заполните внешнюю камеру до уровня, указанного производителем. Загрузите место рядом с иссеченной гелевой полоской с помощью лестницы с молекулярной массой или соответствующего стандарта белка. Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте образцы при напряжении 120 вольт.
Когда краситель Кумасси стекает с геля, остановите прогон и отключите электропитание. Анализируйте гель с помощью стандартных методов электроблоттинга и обнаружения белка на основе антител. Валидация multimer-PAGE показана здесь с помощью иммуноблоттинга.
Захваченный кинезиновый комплекс расщепляется дифио-3-итолом, что свидетельствует о том, что высокомолекулярные агрегаты образуются путем сшивания более мелких заместителей. На рисунке изображены лизаты мозга, обработанные повышенными концентрациями SDS или Triton, увеличивающие обнаружение мономерного альфа-синуклеина при одновременном снижении обнаружения растворимого олигомера тетромера. Здесь представлены репрезентативные результаты multimer-PAGE, используемого для захвата растворимых комплексов в лизате мозга крыс.
Белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга. Ожидаемая мономерная масса каждого белка показана ниже дорожек. Аналогичным образом здесь показан захват мембраносвязанных комплексов.
Multimer-PAGE иногда не удается захватить комплекс, как показано на двухблоттинговом комплексе SDHA. Обсуждение возможных объяснений этому можно найти в текстовом протоколе. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за восемь часов, если она выполнена правильно.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять внутригельное сшивание нативных белковых комплексов с последующим повторным литием геля и разделением с помощью вторичного SDS-PAGE. Не забывайте, что работа с акриламидом может быть крайне опасной и во время литья геля необходимо надевать средства индивидуальной защиты. После этой процедуры отделенные стабилизированные комплексы могут быть элюированы или вырезаны из геля и могут быть проанализированы различными способами, включая иммунодетектирование или масс-спектрометрию в зависимости от потребностей исследователя.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод стабилизации и разделения нативных белковых комплексов из лизатов тканей с использованием новой системы двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Этот метод позволяет анализировать ассоциации белков в условиях, близких к нативным.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Протеомика
- Электрофорез
Теоретические основы
- Понимание белковых комплексов имеет решающее значение для многих биологических исследований.
- Нативные ассоциации белков могут быть лабильными, что затрудняет их анализ.
- Общепринятые биологические методы облегчают применение данной методики.
- Этот метод позволяет использовать индивидуальные подходы к анализу белков.
Цель исследования
- Для выделения и анализа нативных белковых комплексов из лизатов тканей.
- Для стабилизации белковых взаимодействий с целью их более точной идентификации.
- Для предоставления универсального метода, применимого в различных областях исследований.
Используемые методы
- Подготовка к синему нативному полиакриламидному электрофорезу.
- Электрофорез белков при напряжении 150 В.
- Мониторинг продвижения полосы красителя в геле.
- Использование аминореактивного кросс-линкера белков.
Основные результаты
- Успешная стабилизация нативных белковых комплексов.
- Эффективное разделение белков в лизатах тканей.
- Идентификация белковых ассоциаций в условиях, близких к нативным.
Выводы
- Данный метод расширяет возможности анализа белковых комплексов.
- Он может быть адаптирован под различные исследовательские цели.
- Использование общепринятых методов делает данную методику более доступной для исследователей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Метод Multimer-PAGE позволяет специалистам в области биофармацевтических исследований и разработок стабилизировать и разделять нативные белковые комплексы из лизатов тканей в условиях, близких к естественным, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Благодаря сохранению лабильных белковых ассоциаций, которые часто разрушаются при обычной очистке, данный метод повышает достоверность прогнозов при анализе путей и идентификации мишеней для лекарств на основе белковых комплексов. Этот подход обеспечивает трансляционную непрерывность от этапа поиска до доклинической оценки, предоставляя воспроизводимые количественные данные о формировании комплексов.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем фиксации нативных белковых взаимодействий без нарушения нековалентных связей.
- Практическая ценность: используются доступные методы blue-native и SDS-PAGE, знакомые большинству групп молекулярной биологии, что снижает потребность в специализированном обучении.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет стабилизации комплексов для последующей идентификации с помощью иммуноблоттинга или масс-спектрометрии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать разделенные профили комплексов, которые могут служить количественными биомаркерами для стандартизации анализов в рамках скрининговых кампаний.
- Практическая ценность: основана на использовании недорогих и общедоступных реагентов и оборудования, что обеспечивает возможность масштабируемого внедрения в базовых исследовательских центрах.
- Готовность анализа: позволяет получать разделенные с помощью SDS-PAGE комплексы, совместимые с последующими методами детекции, такими как иммунодетекция, что поддерживает интеграцию в высококонтентный скрининг.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Связывает этапы поиска и доклинических исследований, сохраняя целостность комплексов для их валидации в системах, соответствующих патологическим процессам.
- Снижение механистических рисков: Позволяет оценивать формирование комплексов при различных условиях (например, при воздействии детергентов или SDS), что дает информацию о стабильности мишени.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: Обеспечивает принятие решений о продолжении или прекращении разработки на основе стабильности и распространенности комплексов, снижая вероятность неудач на поздних этапах из-за неопределенности механизмов действия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод Multimer-PAGE вписывается в общий цикл разработки лекарств — от идентификации мишени до оптимизации ведущих соединений, обеспечивая механистическую связь с доклинической валидацией за счет возможности анализа нативных белковых комплексов в образцах, полученных из тканей.
- Биологические исследования: Облегчают проверку гипотез и уточнение сигнальных путей за счет выделения эндогенных комплексов из немодифицированных лизатов тканей.
- Скрининг: Обеспечивают разработку методов анализа благодаря воспроизводимому разделению и детекции комплексов, что упрощает оценку влияния соединений на связывание с мишенью.
- Аналитика: Обеспечивают количественное разделение белковых комплексов с помощью вторичного SDS-PAGE, что позволяет сравнивать различные условия или варианты лечения.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность с доклиническим этапом за счет сохранения стабильности комплексов для валидации в моделях заболеваний, способствуя согласованию биомаркеров.
- Корпоративное использование: Функционируют как многократно используемая платформа, а не одноразовый метод анализа, и могут быть адаптированы для различных мишеней и областей заболеваний.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в сетях белковых взаимодействий.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря использованию стандартных рабочих процессов на основе гелей и общепринятых методов электрофореза.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя снизить риски при выборе мишеней на ранних этапах и минимизировать инвестиции в плохо валидированные механизмы.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков, предоставляя прямые доказательства формирования и стабильности комплексов в нативном контексте.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами native PAGE и SDS-PAGE, включая литье гелей и электрофоретическое разделение.
- Необходимо наличие оборудования для электрофореза, источников питания и стандартных реагентов, таких как кросслинкер DSP и SDS.
- Требуется стандартизация между командами для обеспечения согласованного захвата и детекции комплексов в группах по поиску мишеней и доклиническим исследованиям.
- Необходимо учитывать особенности адаптации метода для различных типов тканей и размеров комплексов, так как эффективность разделения может зависеть от молекулярной массы.
- Ограничения связаны с трудностями при разделении крайне крупных комплексов и возможной вариабельностью эффективности кросслинкинга, как отмечено в исходных материалах.
