Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах
May 5th, 2017
Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы позволить исследователям захватывать, разделять и анализировать нативные белковые комплексы, извлеченные из тканевых лизатов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Этот метод может помочь исследователям, изучающим белки, потому что он способен стабилизировать лабильные белковые ассоциации в условиях, близких к нативным, что позволяет идентифицировать их и последующий анализ. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она использует общие биологические методы, поэтому она широко применима и может быть адаптирована к целям отдельного исследователя.
Чтобы начать эту процедуру, подготовьтесь к электрофорезу в нативном полиакриламиде как описано в текстовом протоколе. Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте белки в геле при напряжении 150 вольт, пока полоса красителя не продвинется примерно на два сантиметра в разрешающий слой. В этот момент остановитесь и отключите электропитание.
После разборки аппарата электрофореза отделите стекла гелевой кассеты. Снимите и выбросьте слой укладки. Аккуратно разрежьте гель чуть ниже нижнего края лицевой стороны красителя, стараясь сделать этот срез как можно более гладким и прямым.
Затем выбросьте неиспользованный кусочек геля. Обрежьте все неиспользованные участки по краям гелевой полоски. Осторожно поместите полоску в 10 миллилитров буферизованного физраствора фософата в небольшую емкость и аккуратно перемешайте в течение 30 минут для уравновешивания.
После уравновешивания выбросьте и замените PBS еще на 10 миллилитров. Пипеткой 500 мкл 25 миллимолярного ДСП растворить в диметилсульфоксиде в ПБС и продолжить перемешивание, как и раньше, в течение 30 минут. Через 30 минут слейте раствор DSP.
В 10 мл 0,375 моляра HSCL, pH 8,8, содержащий 2% додецилсульфата натрия для гашения непрореагировавшего DSP. Продолжайте записывать в течение 15 минут. Пока происходит закалка гелевой полоски, приготовьте растворы геля SDS-PAGE по стандартным методам.
Не добавляйте реагенты для полимеризации. После закалки верните синюю родную гелевую полоску до комнатной температуры и залите полоску в новую гелевую кассету. Для этого аккуратно поднимите гель и поместите его на чистую гелевую кассетную распорную пластину.
Сориентируйте полосу так, чтобы она была перевернута от своей предыдущей ориентации, а нижняя часть лицевой стороны красителя была ближе всего к верхней части новой кассеты. Расположите полосу так, чтобы ее верхний край лежал на одном уровне с тем местом, где будет верхний край накладки. Убедитесь, что лицевая сторона красителя параллельна горизонтальным краям стеклянной пластины.
Прижмите одну сторону вырезанной полосы к одной из стенок распорки, оставив место с другой стороны для заливки геля и загрузки стандарта белка или лестницы. Если нижний край гелевой полоски содержит какие-либо неровные или неровные участки, аккуратно срежьте их. После того, как гелевая полоска будет правильно размещена, наложите накладку на распорную пластину.
Слегка надавите, чтобы вытолкнуть все захваченные пузырьки воздуха. Продолжайте собирать аппарат для заливки геля в соответствии с инструкциями производителя. Гелевая полоска иногда смещается при установке верхней пластины.
Это помогает позволить полосе немного свисать над краем верхней пластины, чтобы ее можно было отрегулировать с помощью шпателя для коррекции любых смещений. Добавьте реагенты полимеризации в растворяющий гелевый буфер и залейте его в подготовленную гелевую кассету с помощью серологической пипетки. Заполните гелевую кассету примерно на два сантиметра ниже иссеченной синей нативной гелевой полоски PAGE, чтобы освободить место для слоя укладки.
Затем добавьте 100 микролитров бутанола поверх залитого геля и дайте 30 минут для полимеризации разрешающего слоя, прежде чем вылить бутанол. Далее добавьте реагенты полимеризации в раствор укладывающего геля. С помощью серологической пипетки налейте слой укладки, чтобы заполнить все оставшееся пустое место в гелевой кассете.
Наклоните гелевую кассету во время заливки слоя укладки, чтобы она заполнила пространство под полоской геля и пузырьки воздуха не задерживались. По мере того как буфер для укладки геля заполняет пустое пространство под полоской геля, постепенно возвращайте кассету с гелем на ровное положение. Продолжайте заполнять пустое пространство рядом с иссеченной гелевой полоской с помощью стеклирующего гелевого буфера, пока он почти не переполнится.
Затем дайте слою для укладки полимеризоваться в течение 30 минут. После того, как слой укладки полимеризуется, извлеките гелевую кассету из разливочного аппарата, промойте ее дистиллированной водой и соберите аппарат электрофореза в соответствии с инструкциями производителя. Полностью заполните внутреннюю камеру 1x рабочим буфером SDS-PAGE.
Затем заполните внешнюю камеру до уровня, указанного производителем. Загрузите место рядом с иссеченной гелевой полоской с помощью лестницы с молекулярной массой или соответствующего стандарта белка. Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте образцы при напряжении 120 вольт.
Когда краситель Кумасси стекает с геля, остановите прогон и отключите электропитание. Анализируйте гель с помощью стандартных методов электроблоттинга и обнаружения белка на основе антител. Валидация multimer-PAGE показана здесь с помощью иммуноблоттинга.
Захваченный кинезиновый комплекс расщепляется дифио-3-итолом, что свидетельствует о том, что высокомолекулярные агрегаты образуются путем сшивания более мелких заместителей. На рисунке изображены лизаты мозга, обработанные повышенными концентрациями SDS или Triton, увеличивающие обнаружение мономерного альфа-синуклеина при одновременном снижении обнаружения растворимого олигомера тетромера. Здесь представлены репрезентативные результаты multimer-PAGE, используемого для захвата растворимых комплексов в лизате мозга крыс.
Белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга. Ожидаемая мономерная масса каждого белка показана ниже дорожек. Аналогичным образом здесь показан захват мембраносвязанных комплексов.
Multimer-PAGE иногда не удается захватить комплекс, как показано на двухблоттинговом комплексе SDHA. Обсуждение возможных объяснений этому можно найти в текстовом протоколе. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за восемь часов, если она выполнена правильно.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять внутригельное сшивание нативных белковых комплексов с последующим повторным литием геля и разделением с помощью вторичного SDS-PAGE. Не забывайте, что работа с акриламидом может быть крайне опасной и во время литья геля необходимо надевать средства индивидуальной защиты. После этой процедуры отделенные стабилизированные комплексы могут быть элюированы или вырезаны из геля и могут быть проанализированы различными способами, включая иммунодетектирование или масс-спектрометрию в зависимости от потребностей исследователя.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол представляет метод стабилизации и разделения нативных белковых комплексов из тканевых лизатов с использованием нового двухмерного полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) системы. Он позволяет анализировать ассоциации белков в почти нативных условиях.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Протеомика
- Электрофорез
Фон
- Понимание белковых комплексов важно для многих биологических исследований.
- Нативные белковые ассоциации могут быть лабильными и сложными для анализа.
- Общие биологические методы облегчают применение этой техники.
- Этот метод позволяет использовать индивидуальные подходы к анализу белков.
Цель исследования
- Захват и анализ нативных белковых комплексов из тканевых лизатов.
- Стабилизация белковых ассоциаций для лучшей идентификации.
- Предоставление широко применимого метода для исследователей.
Используемые методы
- Подготовка к голубому нативному полиакриламидному гель-электрофорезу.
- Электрофорез белков при 150 вольтах.
- Мониторинг прогресса красящей полосы в геле.
- Использование аминорецтиного белкового крассоверера.
Основные результаты
- Успешная стабилизация нативных белковых комплексов.
- Эффективное разделение белков в тканевых лизатах.
- Идентификация белковых ассоциаций в почти нативных условиях.
Выводы
- Этот метод улучшает анализ белковых комплексов.
- Он адаптируется к различным исследовательским целям.
- Использование общих методов увеличивает доступность для исследователей.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
