Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах
5 мая 2017 г.
Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).
Общая цель данного протокола — дать исследователям возможность выделять, разделять и анализировать нативные белковые комплексы, извлеченные из лизатов тканей, с помощью полиакриламидного гель-электрофореза. Этот метод может помочь исследователям, изучающим белки, поскольку он позволяет стабилизировать в противном случае лабильные белковые ассоциации в условиях, близких к нативным, что обеспечивает их идентификацию и последующий анализ. Основным преимуществом данной методики является использование общепринятых биологических методов, благодаря чему она широко применима и может быть адаптирована под конкретные цели исследователя.
Для начала данной процедуры подготовьтесь к проведению голубого нативного полиакриламидного гель-электрофореза согласно текстовому протоколу. Подключите электроды к источнику питания и проведите электрофорез белков в геле при 150 вольтах до тех пор, пока полоса красителя не продвинется примерно на два сантиметра в разделяющий слой. На этом этапе остановите процесс и отключите источник питания.
После разборки электрофоретической установки разделите стеклянные пластины кассеты для геля. Удалите и утилизируйте разделяющий слой. Осторожно вырежьте гель чуть ниже нижней границы фронта красителя, стараясь сделать разрез максимально ровным и прямым.
Затем удалите неиспользованный фрагмент геля. Обрежьте любые лишние части по краям полоски геля. Осторожно поместите полоску в 10 milliliters фосфатно-солевого буферного раствора в небольшом контейнере и аккуратно перемешивайте путем встряхивания в течение 30 минут для уравновешивания.
После уравновешивания удалите PBS и замените его новыми 10 миллилитрами. Пипетируйте 500 микролитров 25 миллимолярного DSP, растворенного в диметилсульфоксиде, в PBS и продолжайте перемешивание, как и прежде, в течение 30 минут. Через 30 минут слейте раствор DSP.
Добавьте 10 миллилитров 0,375 молярного HSCL, pH 8,8, содержащего 2% додецилсульфата натрия, чтобы погасить остаточный не вступивший в реакцию DSP. Продолжайте инкубацию в течение 15 минут. Пока гель-полоска находится в процессе гашения, приготовьте растворы для SDS-PAGE геля в соответствии со стандартными методами.
Не добавляйте реагенты для полимеризации. После гашения доведите полоску геля для голубого нативного электрофореза до комнатной температуры и залейте её в новую кассету для геля. Для этого осторожно поднимите гель и поместите его на чистую разделительную пластину кассеты для геля.
Разверните полоску так, чтобы она была перевернута относительно своего предыдущего положения, а нижняя граница фронта красителя находилась ближе к верхней части новой кассеты. Расположите полоску таким образом, чтобы ее верхний край совпадал с будущим верхним краем крышки. Убедитесь, что фронт красителя параллелен горизонтальным краям стеклянной пластины.
Прижмите один край вырезанной полоски к одной из стенок разделителя, оставив место с другой стороны для заливки геля и нанесения стандарта белков или маркера молекулярной массы. Если нижний край полоски геля имеет зазубрины или неровности, осторожно обрежьте их. После того как полоска геля будет правильно расположена, накройте пластину-разделитель верхней пластиной.
Аккуратно надавите, чтобы вытеснить все попавшие внутрь пузырьки воздуха. Продолжите сборку устройства для заливки геля в соответствии с инструкциями производителя. При установке верхней пластины полоска геля иногда смещается.
Рекомендуется оставить полоску так, чтобы она слегка свисала с края верхней пластины; это позволит поправить её шпателем в случае смещения. Добавьте реагенты для полимеризации в буфер для разделяющего геля и залейте его в подготовленную кассету с помощью серологической пипетки. Заполните кассету до уровня примерно на два сантиметра ниже вырезанной полоски геля для Blue Native PAGE, чтобы оставить место для концентрирующего слоя.
Затем добавьте 100 µL бутанола поверх залитого геля и подождите 30 минут до завершения полимеризации разделяющего слоя, после чего слейте бутанол. Далее добавьте реагенты для полимеризации в раствор концентрирующего геля. С помощью серологической пипетки залейте концентрирующий слой, заполнив все оставшееся свободное пространство в кассете для геля.
Наклоните кассету для геля при заливке концентрирующего слоя так, чтобы буфер заполнил пространство под полоской геля и в нем не образовались пузырьки воздуха. По мере заполнения буфером концентрирующего геля пустого пространства под полоской геля постепенно верните кассету в горизонтальное положение. Продолжайте заполнять пространство рядом с вырезанной полоской геля буфером концентрирующего геля почти до самого края.
Затем дайте разделяющему гелю полимеризоваться в течение 30 минут. После полимеризации разделяющего слоя извлеките кассету с гелем из устройства для заливки, промойте ее дистиллированной водой и соберите установку для электрофореза в соответствии с инструкциями производителя. Полностью заполните внутреннюю камеру 1x буфером для электрофореза SDS-PAGE.
Затем заполните внешнюю камеру до уровня, указанного производителем. В лунку рядом с вырезанной полоской геля внесите маркер молекулярной массы или соответствующий стандарт белка. Подключите электроды к источнику питания и проведите электрофорез образцов при напряжении 120 вольт.
Когда краситель Coomassie выйдет за пределы геля, остановите электрофорез и отключите источник питания. Проанализируйте гель с использованием стандартных методов электроблоттинга и определения белков с помощью антител. Валидация multimer-PAGE представлена здесь посредством иммуноблоттинга.
Захваченный комплекс кинезина расщепляется дифио-3-итолом, что свидетельствует о том, что высокомолекулярные агрегаты образуются путем сшивания более мелких компонентов. Здесь показано, что обработка лизатов мозга возрастающими концентрациями SDS или Triton приводила к увеличению детектирования мономерного альфа-синуклеина при одновременном снижении детектирования растворимого олигомерного тетрамера. Здесь представлены репрезентативные результаты мультимерного электрофореза в полиакриламидном геле (multimer-PAGE), использованного для захвата растворимых комплексов в лизате мозга крысы.
Белки определяли с помощью иммуноблоттинга. Ожидаемая мономерная масса каждого белка указана под дорожками. Аналогичным образом здесь показан захват мембранно-связанных комплексов.
Метод Multimer-PAGE иногда не позволяет зафиксировать комплекс, что видно на блоте дыхательного комплекса два SDHA. Обсуждение возможных причин этого явления приведено в текстовом протоколе. После освоения данной техники ее выполнение занимает около восьми часов при условии соблюдения всех правил.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить сшивку нативных белковых комплексов в геле с последующим повторным литьем геля и разделением методом вторичного SDS-PAGE. Не забывайте, что работа с акриламидом может быть крайне опасной, поэтому при литье геля необходимо использовать средства индивидуальной защиты. После выполнения данной процедуры разделенные стабилизированные комплексы можно элюировать или вырезать из геля для последующего анализа различными методами, включая иммунодетекцию или масс-спектрометрию, в зависимости от целей исследователя.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод стабилизации и разделения нативных белковых комплексов из лизатов тканей с использованием новой системы двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Этот метод позволяет анализировать ассоциации белков в условиях, близких к нативным.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Протеомика
- Электрофорез
Теоретические основы
- Понимание белковых комплексов имеет решающее значение для многих биологических исследований.
- Нативные ассоциации белков могут быть лабильными, что затрудняет их анализ.
- Общепринятые биологические методы облегчают применение данной методики.
- Этот метод позволяет использовать индивидуальные подходы к анализу белков.
Цель исследования
- Для выделения и анализа нативных белковых комплексов из лизатов тканей.
- Для стабилизации белковых взаимодействий с целью их более точной идентификации.
- Для предоставления универсального метода, применимого в различных областях исследований.
Используемые методы
- Подготовка к синему нативному полиакриламидному электрофорезу.
- Электрофорез белков при напряжении 150 В.
- Мониторинг продвижения полосы красителя в геле.
- Использование аминореактивного кросс-линкера белков.
Основные результаты
- Успешная стабилизация нативных белковых комплексов.
- Эффективное разделение белков в лизатах тканей.
- Идентификация белковых ассоциаций в условиях, близких к нативным.
Выводы
- Данный метод расширяет возможности анализа белковых комплексов.
- Он может быть адаптирован под различные исследовательские цели.
- Использование общепринятых методов делает данную методику более доступной для исследователей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Метод Multimer-PAGE позволяет специалистам в области биофармацевтических исследований и разработок стабилизировать и разделять нативные белковые комплексы из лизатов тканей в условиях, близких к естественным, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Благодаря сохранению лабильных белковых ассоциаций, которые часто разрушаются при обычной очистке, данный метод повышает достоверность прогнозов при анализе путей и идентификации мишеней для лекарств на основе белковых комплексов. Этот подход обеспечивает трансляционную непрерывность от этапа поиска до доклинической оценки, предоставляя воспроизводимые количественные данные о формировании комплексов.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем фиксации нативных белковых взаимодействий без нарушения нековалентных связей.
- Практическая ценность: используются доступные методы blue-native и SDS-PAGE, знакомые большинству групп молекулярной биологии, что снижает потребность в специализированном обучении.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет стабилизации комплексов для последующей идентификации с помощью иммуноблоттинга или масс-спектрометрии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать разделенные профили комплексов, которые могут служить количественными биомаркерами для стандартизации анализов в рамках скрининговых кампаний.
- Практическая ценность: основана на использовании недорогих и общедоступных реагентов и оборудования, что обеспечивает возможность масштабируемого внедрения в базовых исследовательских центрах.
- Готовность анализа: позволяет получать разделенные с помощью SDS-PAGE комплексы, совместимые с последующими методами детекции, такими как иммунодетекция, что поддерживает интеграцию в высококонтентный скрининг.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Связывает этапы поиска и доклинических исследований, сохраняя целостность комплексов для их валидации в системах, соответствующих патологическим процессам.
- Снижение механистических рисков: Позволяет оценивать формирование комплексов при различных условиях (например, при воздействии детергентов или SDS), что дает информацию о стабильности мишени.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: Обеспечивает принятие решений о продолжении или прекращении разработки на основе стабильности и распространенности комплексов, снижая вероятность неудач на поздних этапах из-за неопределенности механизмов действия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод Multimer-PAGE вписывается в общий цикл разработки лекарств — от идентификации мишени до оптимизации ведущих соединений, обеспечивая механистическую связь с доклинической валидацией за счет возможности анализа нативных белковых комплексов в образцах, полученных из тканей.
- Биологические исследования: Облегчают проверку гипотез и уточнение сигнальных путей за счет выделения эндогенных комплексов из немодифицированных лизатов тканей.
- Скрининг: Обеспечивают разработку методов анализа благодаря воспроизводимому разделению и детекции комплексов, что упрощает оценку влияния соединений на связывание с мишенью.
- Аналитика: Обеспечивают количественное разделение белковых комплексов с помощью вторичного SDS-PAGE, что позволяет сравнивать различные условия или варианты лечения.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность с доклиническим этапом за счет сохранения стабильности комплексов для валидации в моделях заболеваний, способствуя согласованию биомаркеров.
- Корпоративное использование: Функционируют как многократно используемая платформа, а не одноразовый метод анализа, и могут быть адаптированы для различных мишеней и областей заболеваний.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в сетях белковых взаимодействий.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря использованию стандартных рабочих процессов на основе гелей и общепринятых методов электрофореза.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя снизить риски при выборе мишеней на ранних этапах и минимизировать инвестиции в плохо валидированные механизмы.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков, предоставляя прямые доказательства формирования и стабильности комплексов в нативном контексте.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами native PAGE и SDS-PAGE, включая литье гелей и электрофоретическое разделение.
- Необходимо наличие оборудования для электрофореза, источников питания и стандартных реагентов, таких как кросслинкер DSP и SDS.
- Требуется стандартизация между командами для обеспечения согласованного захвата и детекции комплексов в группах по поиску мишеней и доклиническим исследованиям.
- Необходимо учитывать особенности адаптации метода для различных типов тканей и размеров комплексов, так как эффективность разделения может зависеть от молекулярной массы.
- Ограничения связаны с трудностями при разделении крайне крупных комплексов и возможной вариабельностью эффективности кросслинкинга, как отмечено в исходных материалах.
