Разделительный и анализ клеток поджелудочной железы мезенхимы с помощью проточной цитометрии
28 января 2017 г.
Здесь мы опишем метод для выделения клеток в поджелудочной железе микросреды из эмбриональной, неонатальной и взрослой ткани мыши, сосредоточив внимание на выделения мезенхимальных клеток. Этот метод позволяет профилирование экспрессии генов клеток и секреции белка с целью выяснения примесного сигналы, которые регулируют развитие поджелудочной железы, функции и онкогенеза.
Общая цель этой процедуры заключается в выделении мезенхимальных клеток поджелудочной железы для анализа их генов и экспрессии поверхностных маркеров. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития поджелудочной железы, такие как какие сигналы экспрессируются мезенхимальными клетками и как они влияют на развитие эпителия. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он относительно прост и быстр, а также позволяет получить хороший выход отсортированных ячеек.
Начните с помещения внутренних органов в чашку для культивирования, содержащую HBSS, и поместите чашку под стереомикроскоп. Отделите печень и почки, чтобы обнажить поджелудочную железу, с помощью тонких щипцов удалите поджелудочную железу из желудка, двенадцатиперстной кишки и селезенки. Когда каждая поджелудочная железа будет собрана, перенесите ткань в коническую трубку, содержащую свежеприготовленный пищеварительный буфер, и поместите трубку на лед.
Когда все панкреаты будут собраны, перенесите ткани в нагревательный блок с температурой 37 градусов Цельсия на 30 минут с перемешиванием при 700 об/мин, вручную переворачивая трубки три-четыре раза через 15 минут. Если большие кусочки поджелудочной железы все еще присутствуют после первой половины пищеварения, переворачивайте трубку каждые пять минут в течение последних 15 минут и инкубируйте ткань в течение дополнительных пяти-10 минут по мере необходимости. В конце сбраживания поместите пробирки на лед и добавьте по 10 миллилитров холодного HBSS в каждый образец.
Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в двух миллилитрах свежей PBS. Затем отфильтруйте клетки через 35-микронные фильтры в пятимиллилитровые полистирольные пробирки для сбора полистирола с круглым дном и промойте пробирки для сбраживания двумя миллилитрами свежего PBS, процедив промывки в соответствующие пробирки для сбора. Затем снова центрифугируйте клетки и тщательно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы.
Ресуспендируйте клетки в сортировочном буфере в соответствии с возрастом животных и отфильтруйте их через новые 35-микронные клеточные фильтры в новые пятимиллилитровые пробирки для сбора. Введите от 50 до 100 микролитров клеток в новые пробирки FACS для контроля окрашивания, включая пробирку для каждого флуорофора, красителя жизнеспособности, флуоресцентных белков и неокрашенный контроль. Промойте каждую пробирку до четырех миллилитров сортировочного буфера, а затем центрифугируйте.
Затем повторно суспендируйте гранулы в свежем сортировочном буфере в соответствии с возрастом животных. Затем окрашивают клетки красителем для повышения жизнеспособности. Для сортировки клеток перед экстракцией РНК, непосредственно перед началом сортировки, покройте стерильную пробирку объемом 1,5 мл одним миллилитром сортировочного буфера, содержащего ингибитор РНКазы.
Через пять минут закрутите трубку для сбора и удалите жидкость. Сделайте вихревой первый контроль окрашивания и загрузите пробирку в проточный цитометр, чтобы начать определение параметров сортировки. Когда все параметры сортировки будут настроены, загрузите образцы и отсортируйте ячейки по пробиркам для сбора объемом 1,5 миллилитров.
Затем соберите отсортированные клетки методом центрифугирования. Аспирируйте надосадочную жидкость вплоть до гранулы и экстрагируйте РНК в соответствии со стандартными протоколами экстракции РНК. Здесь показан изолированный весь желудочно-кишечный тракт, включая желудок, селезенку, кишечник и поджелудочную железу эмбриона эмбриона на 15,5-й день и щенка на четвертый день после рождения.
Проточный цитометрический анализ отдельных клеток из эмбриональных, неонатальных и взрослых тканей поджелудочной железы, выделенных, как только что продемонстрировано, показывает, что трансгенные ткани поджелудочной железы всех анализируемых возрастов содержат различные популяции клеток, меченных YFP. После сортировки эти мезенхимальные клетки могут быть культивированы для создания клеточной линии, по крайней мере, на пять пассажей. Обратите внимание на фиброзную морфологию культивируемых клеток, типичную для мезенхимальных клеток.
Отсортированные клетки экспрессируют панмезенхимальный маркер вентин, проанализированный с помощью количественной ПЦР после экстракции РНК и синтеза кДНК. Кроме того, экспрессия маркеров поверхности изолированных клеток поджелудочной железы указывает на то, что все флуоресцентно меченые клетки в трансгенной YFP поджелудочной железе экспрессируют CD9, гликопротеин клеточной поверхности, который, как сообщается, экспрессируется фибробластами. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование РНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы об экспрессии генов мезенхимальных клеток.
Обзор
В данной статье описывается метод выделения мезенхимальных клеток поджелудочной железы из тканей эмбрионов, новорожденных и взрослых мышей. Эта методика позволяет анализировать экспрессию генов и секрецию белков, что дает представление о внешних сигналах, влияющих на развитие поджелудочной железы и туморогенез.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Биология развития
- Онкология
Теоретические основы
- Понимание роли мезенхимальных клеток в развитии поджелудочной железы имеет решающее значение.
- Мезенхимальные клетки обеспечивают внешние сигналы, которые влияют на развитие эпителия.
- Изоляция этих клеток может расширить наши знания о функционировании поджелудочной железы и связанных с ней заболеваниях.
- Данный метод применим к различным стадиям развития мышей.
Цель исследования
- Выделение мезенхимальных клеток поджелудочной железы для анализа экспрессии генов и поверхностных маркеров.
- Исследование сигналов, экспрессируемых мезенхимальными клетками.
- Изучение влияния этих сигналов на развитие эпителия.
Используемые методы
- Сбор тканей поджелудочной железы мышей и их переваривание с использованием буфера.
- Фильтрация и сортировка клеток методом проточной цитометрии.
- Окрашивание клеток для определения жизнеспособности и анализа поверхностных маркеров.
- Экстракция РНК для последующего анализа.
Основные результаты
- Были выявлены отчетливые популяции мезенхимальных клеток, меченых YFP, в разных возрастных группах.
- Сортированные клетки демонстрировали типичную фиброзную морфологию.
- Была подтверждена экспрессия пан-мезенхимального маркера виментина.
- Экспрессия CD9 наблюдалась в флуоресцентно меченых клетках.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к выделению мезенхимальных клеток поджелудочной железы.
- Полученные данные могут быть использованы в будущих исследованиях развития поджелудочной железы и ее туморогенеза.
- Дальнейшее применение может включать секвенирование РНК для комплексного анализа экспрессии генов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точная изоляция и анализ мезенхимальных клеток поджелудочной железы с помощью проточной цитометрии позволяют осуществлять направленное исследование факторов микроокружения, которые регулируют развитие и патологию поджелудочной железы. Эта возможность способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней для программ, сосредоточенных на биологии поджелудочной железы, туморогенезе и регенеративной медицине. Интеграция данных рабочих процессов повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска и в точках принятия решений на доклиническом этапе в портфелях биофармацевтических компаний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать сигналы, исходящие от мезенхимальных клеток и влияющие на дифференцировку и пролиферацию эпителия.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем выделения популяций клеток для профилирования экспрессии генов и белков.
- Способствует механистическому анализу рисков в отношении кандидатных путей, участвующих в развитии и заболеваниях поджелудочной железы.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение высокоочищенных жизнеспособных популяций мезенхимальных клеток для последующей разработки анализа.
- Стандартизирует изоляцию и маркировку клеток для воспроизводимого проточного цитометрического анализа на разных стадиях развития.
- Позволяет проводить количественную оценку экспрессии поверхностных маркеров для подтверждения готовности к скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет изолированные популяции клеток с соответствующими моделями заболеваний для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность этапов от поиска до доклинической валидации, позволяя проводить анализы РНК и белков.
- Снижает биологическую неопределенность в доклинических моделях, проясняя вклад микроокружения.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая возможность изоляции, характеристики и последующего анализа мезенхимальных клеток поджелудочной железы на стадиях от эмбриональной до взрослой.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез о мезенхимально-эпителиальных взаимодействиях и выяснение путей передачи сигналов.
- Скрининг: Предоставляет воспроизводимые количественные данные проточной цитометрии для сортировки клеток на основе маркеров.
- Аналитика: Предоставляет данные об экспрессии генов и белков для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывает изолированные популяции клеток с моделями заболеваний для согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает стандартизированный масштабируемый рабочий процесс для многократного использования в рамках различных программ и стадий разработки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях поджелудочной железы.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы изоляции и анализа клеток.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет уточнения факторов микроокружения.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и продвижение активов, ориентированных на поджелудочную железу и ее микроокружение.
Рекомендации по внедрению
- Требуются навыки препарирования тканей, ферментативного расщепления и работы с проточным цитометром.
- Необходим доступ к высококачественным проточным цитометрам и инфраструктуре для сортировки клеток.
- Требуются стандартизированные протоколы маркировки клеток, оценки их жизнеспособности и экстракции РНК.
- Метод адаптируем для эмбриональных, неонатальных и взрослых моделей мышей при соответствующей корректировке протокола.
- Результат зависит от тщательного подбора и валидации маркеров для точной изоляции популяций клеток.
