Использование трассировки Eyeblink классический подготовлять для оценки гиппокампа дисфункции в мышиной модели плода алкоголь спектра расстройств

Общая цель данного эксперимента — продемонстрировать, как использование классического кондиционирования реакции мигания с интервалом (trace eyeblink classical conditioning), формы ассоциативного обучения, может помочь в выявлении дисфункции гиппокампа на модели фетального алкогольного спектра расстройств у крыс. Новорожденным крысятам вводят высокую дозу алкоголя (концентрация 11,9% по объему) по схеме, имитирующей запойное употребление, в период, эквивалентный третьему триместру беременности у людей с точки зрения развития мозга.

Такой режим воздействия алкоголя и дозировка являются ключевыми факторами в развитии дефицитов функций мозга на протяжении всей жизни, имитирующих случаи FASD у людей. Важной областью мозга, которая поражается при раннем воздействии алкоголя, является гиппокамп. После достижения крысами взрослого состояния проводится исследование дисфункции гиппокампа с помощью метода классического обусловливания реакции мигания.

Это форма ассоциативного обучения высокого порядка, которая зависит от целостности гиппокампа. В период с четвертого по девятый дни после рождения крысят каждое утро взвешивают и записывают их массу. Затем объемы кормления определяют по заранее распечатанной таблице на основании массы тела.

Крысятам вводят 11,9%-ный по объему раствор алкоголя в течение двух кормлений с интервалом в два часа. Общая суточная доза алкоголя составляет 5,25 г/кг в сутки. Данная парадигма эпизодического воздействия предполагает введение 0,278 мл алкоголя на грамм массы тела за одно кормление в виде раствора в молоке.

Извлеките молоко, содержащее алкоголь, с помощью стерильного шприца объемом 1 мл. Затем выдавите излишки раствора, чтобы получить точно необходимое количество. Погрузите кончик трубки PE-10 в свежее кукурузное масло.

Это облегчает введение. Измерьте длину трубки PE-10 от рта щенка до его желудка. При необходимости отрегулируйте стопор PE-50, чтобы он служил визуальным ориентиром для точки остановки.

Осторожно введите трубку PE-10 в рот щенка. Обычно при достижении глотки будет ощущаться некоторое сопротивление. Манипулируйте трубкой до тех пор, пока ее кончик не согнется и не войдет в просвет пищевода.

Старайтесь не допустить соскальзывания трубки назад, так как она может быть скользкой из-за масла. Продолжайте продвижение по пищеводу; когда кончик трубки пройдет через гастроэзофагеальный сфинктер, он попадет в желудок. Остановитесь в этой точке, зафиксируйте насос и введите раствор.

Эту процедуру следует выполнять медленно. Осторожно извлеките трубку PE-10 и осмотрите детеныша на наличие обратного затека раствора, крови или физических повреждений. Если с детенышем всё в порядке, верните его к остальным членам помета.

Для получения списка конкретных инструментов, используемых в процедуре хирургической операции на веке, обратитесь к письменному протоколу и списку материалов. Стерилизуйте операционное поле approved дезинфицирующим средством, а все хирургические инструменты и расходные материалы предварительно автоклавируйте. После введения крысе надлежащей анестезии изофлураном выбрейте шерсть на голове с помощью триммера, открыв достаточную область кожи для места разреза и левого века.

Кожу стерилизуют, трижды попеременно протирая её 70% isopropyl alcohol и повидон-йодом. Согласно стандартной процедуре, зафиксируйте крысу в стереотаксическом устройстве с помощью ушных фиксаторов. Приступайте к операции, когда крыса достигнет соответствующей стадии анестезии.

С помощью лезвия скальпеля сделайте передне-задний разрез по срединной линии. Разрез должен обнажить область перед глазами и немного позади линии лямбдовидного шва. Аккуратно соскребите лезвием скальпеля надкостницу с верхней части черепа, стараясь не вызвать избыточного кровотечения.

Удалите излишки соединительной ткани и крови с помощью ватной палочки, промывая область стерильным физраствором между этапами очистки. Просверлите отверстие непосредственно за венечным швом в одной из теменных костей. Удалите кровь и костные фрагменты с помощью ватной палочки.

С помощью щелевых пинцетов захватите винт 0 80. Используя часовую отвертку, вкрутите винт в отверстие, затягивая его ровно настолько, чтобы не повредить ткани коры головного мозга, обычно на три-четыре полных оборота. Повторите ту же процедуру для закрепления остальных винтов.

Должно быть зафиксировано два винта билатерально за корональным швом и один на правой теменной кости перед лямбдовидным швом. Захватите верхний кожный лоскут в месте разреза у левого глаза четырехдюймовым хирургическим пинцетом и направьте трехдюймовый хирургический пинцет к углу этого глаза. Возьмите одну иглу калибра 26G длиной 3/8 дюйма и введите ее через угол века.

Поверните иглу так, чтобы срез был направлен вверх. Введите вторую иглу в середину века. С помощью тонкого пинцета захватите проволоку 3T и вставьте ее в одну из игл.

Необязательно вставлять его до самого конца. Повторите ту же процедуру для второго провода 3T. Одной рукой удерживайте обе иглы, а другой — головной блок.

Одним плавным движением вытяните иглы из века, перемещая головку электрода в том же направлении. Придерживая головку EMG одной рукой, другой рукой с помощью трехдюймовых перевязочных пинцетов оберните провод 10T вокруг одного или обоих винтов с правой стороны. Аккуратно уложите провод так, чтобы он не выступал за пределы винтов.

Перед переходом к следующему этапу необходимо центрировать головной блок ЭМГ. С помощью четырехдюймового хирургического зажима создайте небольшой карман, отделяя кожу (поверхностную фасцию) от височной мышцы. После создания кармана с помощью ирисных ножниц удалите большее количество соединительной ткани, продвигаясь в сторону угла левого глаза.

Будьте осторожны, чтобы не погрузиться слишком глубоко и не повредить кровеносные сосуды. Возьмите биполярный электрод и изогните его провод так, чтобы он соответствовал кривизне височной мышцы. Два штыря должны располагаться позади левого глаза, а нижний конец биполярного электрода — непосредственно на черепе.

Смешайте порошок Ortho Jet с жидкими компонентами до получения консистенции пасты. Нанесите пасту микрошпателем вокруг места разреза. Будьте осторожны, чтобы паста не попала в глаза крысе, и следите за тем, чтобы она не растекалась.

Дождитесь, пока Ortho Jet достигнет полусухого состояния, затем с помощью пинцета удалите излишки акрила с головки EMG-регистратора и с резьбы биполярного электрода. Отрежьте лишний провод 3T, оставив несколько сантиметров для дальнейшей работы.

Осторожно удалите ПТФЭ-изоляцию с каждого провода 3T с помощью микродиссекционных пинцетов. Это позволит им вступить в контакт с круговой мышцей глаза. Используя микродиссекционные пинцеты, сформируйте крючки на каждом конце проводов 3T.

Обрежьте лишний провод, стараясь не отрезать слишком много, чтобы оставшийся конец провода не втянулся обратно в веко. Кабели изготовлены внутри лаборатории. Сначала подключается белый биполярный штекер, что обеспечивает подачу стимулирующего воздействия ультразвуковым шоком.

После этого подключается оранжевый штекер головного блока ЭМГ. Он регистрирует электромиографическую активность при моргании крысы. Оба штекера ведут к круглому коммутатору в верхней части рычага, который обеспечивает непрерывность сигнала при свободном перемещении крысы.

Изолятор стимулов включается, и проводится окончательная проверка оборудования. Это включает в себя настройку базовой линии ЭМГ до уровня, который виден на экране компьютера. В первой сессии интенсивность шока сначала устанавливается на уровне 4 mA, после чего она будет увеличиваться на 4 mA каждые две попытки.

Эта процедура привыкания позволяет крысе адаптироваться к шоковому стимулу. К восьмому испытанию интенсивность шока поддерживается на уровне 1.6 milli amps на протяжении всей данной сессии и всех последующих сессий. Отдельный компьютер управляет четырехканальным цифровым осциллографом, что позволяет проводить диагностику сигнала в режиме реального времени.

Обратите внимание на моргание, зафиксированное у крысы в первом боксе. Осциллограф также показывает, что исходный сигнал ЭМГ относительно чистый с низким уровнем шума. Веб-камеры также позволяют нам вести наблюдение за каждой крысой.

На данном скриншоте из программного обеспечения blink версии 4.0 показана эпоха одного испытания длительностью 1400 миллисекунд. В первые 280 миллисекунд стимулы не предъявляются для получения показателей фоновой ЭМГ-активности. Желтая линия обозначает пороговую линию: любой ЭМГ-ответ, превышающий среднее значение базовой линии перед предъявлением условного стимула (CS) на 4 вольта, будет считаться реакцией моргания.

Звуковой стимул интенсивностью 85 децибел подается на отметке 280 миллисекунд. Звук звучит в течение 380 миллисекунд, что соответствует временной точке 660 миллисекунд. После его прекращения следует интервал длительностью 500 миллисекунд, в течение которого стимулы не подаются. Этот период называется интервалом прослеживания (trace period), в течение которого крыса должна связать прекращение подачи тонального условного стимула (CS) с началом подачи шокового безусловного стимула (US), который будет подан на отметке 1160 миллисекунд.

Безусловный раздражитель (БР) в виде удара тока длится 100 миллисекунд. Естественно, такой БР вызывает защитную реакцию мигания, известную как безусловный ответ (БО), который измеряется в временном окне длительностью 140 миллисекунд. Одна сессия обучения состоит из 100 предъявлений.

Проводится 90 проб, в которых условный стимул (CS) и безусловный стимул (US) предъявляются совместно, и каждую десятую пробу предъявляется только CS. В каждой сессии содержится 10 проб с одним лишь CS. Эти пробы позволяют определить, сформировалась ли ассоциативная связь между CS и US.

В виде условных реакций (УР) ответ проявляется при отсутствии шокового безусловного стимула (БС). Межпробный интервал в среднем составляет 30 секунд, чтобы начало каждой пробы было непредсказуемым. В любой данной пробе крыса может моргнуть в любой момент времени, и её ЭМГ будет зарегистрирована программным обеспечением.

Любое отдельное моргание, превышающее пороговую линию, будет считаться реакцией, относящейся к одной из четырех категорий в зависимости от времени ее возникновения и эпохи пробы. Если крыса моргает в течение первых 80 миллисекунд после начала подачи тонового CS, реакция считается реакцией испуга или SR. Это неассоциативная реакция, которая свидетельствует о сенсомоторных функциях, но не о самом обучении ассоциации CS-US. Если моргание происходит после периода SR, но до подачи шокового US, то считается, что животное продемонстрировало условный ответ.

Как упоминалось ранее, КР является основным показателем ассоциативного обучения. Не ожидается, что КР разовьется на ранних этапах обучения, однако по мере продолжения тренировок в течение многих проб и сессий такие типы ответов становятся более частыми, их амплитуда возрастает, а время возникновения становится более точным. Мы разделяем КР на два типа: общие КР и адаптивные КР.

Общее количество условных реакций (УР) отражает общую способность к обучению, в то время как адаптивные УР отражают способность животного точно определять время моргания. В качестве способа подготовки к воздействию период адаптивной УР составляет 200 миллисекунд до начала воздействия безусловного стимула (БС) в виде шока. У млекопитающих с интактным гиппокампом проявление адаптивных УР свидетельствует о значительном участии гиппокампа в правильном определении времени моргания относительно подачи двух стимулов.

По самой своей природе классическое обусловливание моргания с интервалом (trace conditioning) усваивается гораздо труднее, чем классическое обусловливание моргания с задержкой (delay conditioning), при котором тональный условный стимул (CS) и ударный безусловный стимул (US) перекрываются во времени. Хотя выражение условных реакций (CR) может варьироваться от одного субъекта к другому и может быть серьезно нарушено при воздействии на отдельные нейронные цепи мозга, ожидается, что безусловная реакция (UR) будет проявляться при каждом совместном предъявлении CS и US. Таким образом, этот показатель отражает сенсомоторные функции и, подобно реакциям испуга, сам по себе не указывает на изучение ассоциации между CS и US.

В следующей серии видеоклипов вы увидите настройку программного обеспечения и начало тренировки моргания. Запускается программа для регистрации морганий и подключаются два соответствующих файла: файл крысы, содержащий данные о субъекте, и файл кондиционирования моргания по следу.

Программа установлена и готова к началу обучения. С началом обучения обратите внимание на таймер в правом нижнем углу экрана, который ведет обратный отсчет до следующей попытки. Перед вами видеозапись в реальном времени первой сессии, попытки 15, в которой проявляется БР, но КР еще не сформировались.

Вот воспроизведение на одной трети скорости. В следующей серии клипов вы увидите скриншоты одной и той же контрольной крысы без интубации в процессе прохождения шести тренировочных сессий. В конечном итоге животное демонстрирует как полные условные реакции (УР), так и адаптивные УР.

Ниже представлена видеозапись шестой сессии, попытки 96, в которой наблюдаются два моргания: одно является адаптивным КР, а другое — БР. Вот повтор с трехкратным замедлением. В этом финальном клипе вы увидите видеозапись крысы с алкогольной интубацией во время последней попытки шестой сессии (попытка только с КС); даже после 600 тренировочных попыток животное не демонстрирует надежный адаптивный КР. После сбора данных проводится отбор с целью удаления неудачных попыток, характеризующихся сильными шумовыми артефактами и необычной базовой ЭМГ-активностью перед предъявлением КС, с использованием встроенного алгоритма поиска выбросов.

Успешные серии проб, которые были сохранены, подвергались дальнейшему анализу на предмет наличия SR, UR, общих CR и адаптивных CR в отношении процента ответов, амплитуды, латентности и других критических показателей. Средние значения адаптивных CR за шесть сессий обучения представлены в этом первом наборе результатов. Как показатели процента, так и амплитуды были статистически значимы при сравнении группы с интубацией алкоголем и двух контрольных групп с сессии два по сессию шесть.

Это указывает на то, что частота и сила адаптивных условных реакций были нарушены у крыс, подвергавшихся воздействию алкоголя в ранний период развития. Средние безусловные реакции представлены в этом втором наборе результатов. Показатели как частоты, так и амплитуды не имели статистически значимых различий ни в одной из групп.

Эти результаты указывают на то, что раннее воздействие алкоголя не нарушило способность крыс моргать в ответ на безусловный стимул, а проявленный ими дефицит был вызван неспособностью правильно связать условный стимул (CS) и безусловный стимул (US) в процессе приобретения навыка. В данном эксперименте мы исследовали взаимосвязь между состоянием мозга и поведением, определив, влияет ли воздействие алкоголя в период развития, осуществляемое по типу «запойного» потребления, на гиппокамп, что отражается в нарушениях классического кондиционирования реакции моргания с интервалом. Действительно, классическое кондиционирование реакции моргания является полезным инструментом для оценки нейроповеденственных последствий, связанных с воздействием алкоголя в период развития мозга.

Этот метод весьма универсален, поскольку путем изменения параметров стимула или требований к ассоциативному обучению можно оценить функциональную целостность различных систем мозга за пределами гиппокампа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о тонкостях введения алкоголя новорожденным крысятам, имплантации электродов и проведении процедуры тестирования рефлекса мигания. Благодарим вас за просмотр этого видео.