Микрожидком Flow камера Модель тромбоцитами трансфузиологии и гемостаза меры тромбоцитов Отложение и фибрина Формирование в режиме реального времени

Общая цель этого микрофлюидного эксперимента заключается в одновременном измерении отложения тромбоцитов при образовании фибрина на реакционноспособной поверхности в условиях потока с помощью видеомикроскопии в реальном времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансфузионной медицины о влиянии препарата концентрата тромбоцитов на прокоагулянтную природу переливаемой крови. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он облегчает одновременный анализ функции тромбоцитов и коагуляции в потоке, что позволяет исследовать взаимодействие между обоими процессами.

Хотя этот метод может дать представление о прокоагуляции, индуцированной контактным путем, он также может быть применен для изучения внешнего пути путем покрытия липидированным тканевым фактором. Демонстрировать процедуру будет Розали Девлу, техник из лаборатории. Начните настройку проточной камеры микрофлюидики с пипетирования 0,8 микролитра свежевосстановленного коллагена на пять шестых длины каждого канала на одном конце нового одноразового микрофлюидного биочипа с восемью прямыми параллельными каналами и пометьте этот конец микрочипа как выход

Инкубируйте биочип при температуре четыре градуса Цельсия в течение не менее четырех часов во влажном и закрытом контейнере. По окончании инкубации заполните закодированные каналы в равное количество Y-образных каналов в смесительном биочипе с блокирующим буфером. Верните микрочип в контейнер на один час при комнатной температуре.

Затем поместите булавку в один конец двух восьмисантиметровых и одного двухсантиметрового куска трубки и в оба конца одного куска трубки длиной 46 сантиметров для каждого используемого канала. Затем используйте программное обеспечение Nanopump для промывки всех жидкостей насоса в подключенной трубке дистиллированной водой и шприцем в соединительном штифте шприца, чтобы заполнить все остальные трубки блокирующим буфером. Затем закрепите закодированный биочип на автоматизированном предметном столике микроскопа с помощью гнезда для лабораторных ножниц, чтобы зафиксировать смешивающий биочип на той же высоте, что и предметный столик микроскопа.

С помощью штифтов в восьмисантиметровых трубках закрепите эти кусочки трубки на входе смесительного биочипа и поместите свободный конец каждой пробирки в пробирку с буферным физиологическим раствором HEPES. Теперь соедините закодированный биочип со смесительным биочипом с помощью 46-сантиметрового отрезка трубки по гибкой, но прямой линии. Прикрепите соединительный штифт шприца к люэр-совместимой трубке промывочного насоса.

Затем подсоедините штифт к свободному концу двухсантиметрового куска трубки и закрепите другой конец трубки к выходному отверстию закодированного биочипа. Затем промойте все трубки и каналы одним миллилитром HBS. Чтобы подготовить перфузионные насосы, откройте программное обеспечение Microfluidic Perfusion Pump Driver и дважды щелкните значок шприцев, чтобы инициализировать насосы.

Выберите тип шприца, который будет использоваться, и отсоедините промывочный насос и подключенную к нему двухсантиметровую трубку. Подсоедините отсоединенную двухсантиметровую трубку с помощью соединительного штифта шприца к люэровскому замку куска толстостенной трубки для отходов и с помощью шприца заполните толстостенную трубку стандартным раствором пепсина. Затем закрепите открытый конец толстостенной трубки зажимом Кохера.

Прикрепите трубку к выходному отверстию закодированного биочипа. Отсоедините две трубки от смесительной проточной камеры вместе и выбросьте контейнеры с HBS. После получения образца крови в контейнерах с вакуумированным цитратом натрия центрифугируйте пробирки и перенесите обогащенную тромбоцитами плазму в новую центрифужную пробирку.

Снова уменьшите емкости с обогащенной тромбоцитами плазмой. Затем перенесите надосадочную жидкость, бедную тромбоцитами, в другую центрифужную пробирку. Затем используйте иглу 21 калибра, чтобы перфорировать дно контейнеров с цитратом натрия, чтобы упакованные эритроциты могли капать в новую коническую трубку.

Когда все упакованные эритроциты собраны, аккуратно восстановите кровь, объединив разделенные упакованные эритроциты с бедной тромбоцитами плазмой, и добавьте подготовленные для переливания тромбоциты банка крови для получения образцов с 40%-ным гематокритом и 2,5 умножить на 10 до пятой концентрации тромбоцитов на микролитр до конечного объема 2,5 миллилитра и получить общий анализ крови. Далее добавьте 13 микролитров меченого флуорофором фибриногена в полистирольную коническую трубку. Далее следует один миллилитр восстановленной крови.

Смешайте еще один миллилитр крови с двумя микролитрами флуоресцентного тромбоцитарного красителя и сложите помеченные образцы крови вместе. Затем аккуратно переверните смешанные образцы крови и инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Перед началом перфузионного анализа сфокусируйте оптику микроскопа на коллагеновые волокна, прилипшие к дну первого канала.

С помощью программного обеспечения для сбора данных определите область интереса в выбранном канале. Загрузите один миллилитр предварительно подогретого буфера для свертывания крови в один миллилитр шприца и установите шприц на перфузионный насос. После второй мягкой инверсии загрузите кровь в двухмиллилитровый шприц и установите шприц на перфузионный насос.

Затем с помощью соединительного штифта шприца прикрепите оба шприца к одному куску восьмисантиметровой трубки и заправьте соединители и трубки со скоростью 400 микролитров в минуту. Когда все трубки будут заполнены буфером для свертывания крови или кровью, прикрепите другой конец обеих трубок к разделенным ножкам Y-образного канала в биочипе для смешивания. Затем снимите зажим Кохера на выходе из отработанной трубки и начните перфузию со скоростью 4,4 микролитра в минуту для буфера для свертывания крови и 44 микролитра в минуту для восстановленной крови.

Записывайте изображения каждые 10 секунд в течение 30 минут в режиме реального времени, прекращая работу насосов и получение изображений через 30 минут или когда сигнал становится насыщенным. Затем выбросьте все трубки и шприцы как биологически опасные отходы. Это видео представляет собой отличный пример накопления тромбов тромбов и отложения фибрина.

В начале перфузии тромбоциты прилипли к реактивной поверхности, что привело к устойчивому увеличению регистрируемой зеленой флуоресценции. Во время этой фазы адгезии наблюдается небольшая флуоресценция фиолетового цвета, указывающая на то, что фибрин образуется лишь незначительно. После начала коагуляции сильный флуоресцентный фибрин быстро осаждается, а зеленая флуоресценция тромбоцитов накапливается примерно с той же скоростью.

Таким образом, момент начала коагуляции может быть экстраполирован как фактор, определяющий потенциал прокоагулянта тромбоцитов. Добавление ингибитора кукурузного трипсина в восстановленную кровь не влияет на адгезию тромбоцитов, но свертывание не начинается в течение всего эксперимента по перфузии. При увеличении количества тромбоцитов в восстановленном образце скорость адгезии, накопления и коагуляции увеличивается линейно.

Момент начала значительно сокращается за счет увеличения концентрации тромбоцитов, что позволяет предположить, что для запуска коагуляции требуется пороговое количество активированных депонированных тромбоцитов. Кроме того, при парном анализе каналов, покрытых только коллагеном, или в сочетании с рекомбинантным липидированным тканевым фактором, начало коагуляции происходит значительно быстрее, хотя ни общая скорость коагуляции, ни накопление тромбоцитов не различаются между различными условиями. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперимент в микрофлюидной проточной камере с восстановленной кровью с двойной меткой для одновременного анализа функции тромбоцитов и коагуляции.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области трансфузионной медицины к изучению взаимодействия между тромбоцитами и свертыванием при потоке. В этом видео мы сосредоточились на демонстрации стандартизированного эксперимента. Но изменения в поверхностном покрытии, защитных напряжениях или концентрации кальция могут быть введены для ответа на конкретные исследовательские вопросы, представляющие интерес.