Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака

Общая цель этой микрохирургической техники заключается во введении клеток колоректальной опухоли в стенку слепой кишки для индуцирования воспроизводимых и метастатических колоректальных опухолей у мышей. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии циркулирующих опухолевых клеток, его основными преимуществами являются высокая воспроизводимость и однородность опухолей, позволяющая достоверно прогнозировать стадию и предсказывать циркулирующие опухолевые клетки. Начните с использования атравматических щипцов для тщательной экстериоризации слепой кишки мыши с ослабленным иммунитетом в возрасте от шести до восьми недель.

Размещение глухого конца слепой кишки на животе так, чтобы мешочек был направлен краниально. Для внутрикишечной инъекции установите стандартный одно-миллилитровый шприц, оснащенный канеллой 30 калибра, и загрузите в него опухолевые клетки на микроинъекционный насос, установленный на микроманипуляторе. Далее с помощью атравматичных щипцов осторожно обхватите кончик слепой кишки и с помощью вторых щипцов, смоченных теплым физиологическим раствором, аккуратно разгладьте слепую кишку движениями вниз.

Теперь переместите животное под бинокулярный хирургический микроскоп и так, чтобы канелла была прямо параллельна слепой кишке и над ней, используйте два атравматичных щипца, чтобы осторожно растянуть ткань на обоих концах внешнего конца слепой кишки. Медленно протяните слепую кишку над канеллой, стараясь не продырявить весь пояс стенки или серозу за пределами начальной точки проникновения, и поместите канеллу над кровеносными сосудами и под тонкой полупрозрачной мембраной внутри пояса стенки. Когда канелла будет на месте, используйте ножной переключатель, чтобы ввести 20 микролитров клеток в течение 20 секунд.

Между тонкой полупрозрачной серозной выстилкой, над интрамуральными кровеносными сосудами и мышечными участками. Когда все клетки будут введены, осторожно удалите канеллу и поместите сухую подкачку под слепую кишку. Чтобы предотвратить искусственную перитонеальную диссеминацию, лизните все вытекшие клетки с помощью тщательного промывки дистиллированной водой и аккуратно верните слепую кишку в брюшную полость.

Закройте брюшную стенку быстро рассасывающимися бегущими нитями, на коже – хирургическими раневыми зажимами. Затем поместите мышь на нагревательный коврик, установленный на 38 градусов по Цельсию с контролем до полного лежания. Чтобы изолировать циркулирующие опухолевые клетки, в соответствующей экспериментальной конечной точке заполните 15-миллилитровые конические пробирки пятью миллилитрами среды градиента плотности на пробирку и осторожно перенесите образцы цельной крови, собранные у животных-носителей опухолей, на слои градиента плотности.

Разделите ячейки центрифугированием и тщательно восстановите границу раздела, содержащую мононуклеарные ячейки. Пипетируйте мононуклеарные ячейки в новую 15-миллилитровую пробирку для второго центрифугирования. Затем следует промывка трубок в PBS.

После второй промывки повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах PBS, дополненных ЭДТА и добавьте четыре микролитра антител anti amp camp к каждому образцу, для 20-минутной инкубации на льду в темноте. Затем с помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте примерно один сантиметр круга в одной стерильной шестисантиметровой чашке Петри на образец и добавьте 700 микролитров буфера для сбора в каждый круг, а затем 50 микролитров клеточной суспензии. Используйте микроскоп, чтобы проверить плотность клеток, и дайте образцам осесть в течение примерно пяти минут.

Затем просейте каплю клеток на положительный результат и с помощью микроманипулятора перенесите интересующие клетки в 15 микролитров соответствующего буфера для предполагаемого последующего анализа. Использование колоректальных клеток в этой модели надежно приводит к большему количеству мышей в течение 35 дней после инъекции опухолевых клеток, при этом первичные опухоли имеют размер около 10 миллиметров, а метастазы в печень и легкие, а также циркулирующие опухолевые клетки почти всегда присутствуют. Кроме того, циркулирующие опухолевые клетки могут быть легко изолированы для последующего анализа.

После освоения и правильного выполнения эта техника может быть выполнена в течение 10 минут, что способствует образованию однородных и метастатических опухолей, которые могут быть использованы как для терапевтических, так и для молекулярных исследований. Ограничения модели включают в себя ее зависимость от клеточного лизиса, который имеет свои собственные ограничения, а также иммунодефицит мышей, оба из которых могут быть преодолены с помощью мутантных клеток колоректального рака. Благодаря своей простоте, эта модель может быть ценным дополнением к существующим в настоящее время моделям колоректального рака.