Organotypic гиппокампа ломтик культур как модель для изучения нейропротекции и инвазии опухолевых клеток

Подготовка и нарезка с помощью вибратома. Для стабилизации мозга во время процедуры нарезки необходимы три блока агара. Во избежание загрязнения используйте набор инструментов, прошедший автоклавирование.

Удалите агар. Образец следует высушить на фильтровальной бумаге перед приклеиванием к металлической пластине с помощью медицинского цианоакрилатного клея. С помощью шпателя извлеките мозг и осторожно поместите его в чашку Петри, заполненную подготовительной средой.

Затем слегка промокните мозг фильтровальной бумагой. Нанесите на металлическую пластину медицинский цианоакрилатный клей. С помощью пинцета и шпателя закрепите мозг на держателе для образцов.

Используйте два ранее подготовленных кусочка агара для обеспечения механической стабильности с обеих сторон. На этом этапе мозг следует поместить рядом с блоком агара и стабилизировать двумя дополнительными блоками, чтобы предотвратить повреждение ткани при нарезке. Поместите металлическую пластину в вибратом и залейте ткань холодным средораздением для подготовки.

После этого выполните горизонтальное препарирование ткани на срезах толщиной 350 micrometers с помощью вибротома. Перенесите срезы в чашку Петри, используя конец сломанной пастеровской пипетки для их сбора. Содержите срезы мозга в холодном preparing medium.

Оцените срезы оптически с помощью бинокулярного микроскопа. Отделите область гиппокампа и введитесь во внутреннюю кору, используя скальпель с круглым лезвием размера 15. Важно отобрать только те срезы с неповрежденной цитоархитектоникой, которые были изолированы из средней части гиппокампа между дорсальным и вентральным гиппокампом.

OHSC низкого качества следует немедленно утилизировать. Перенесите два-три полученных среза в инсерт для культивирования клеток с размером пор 0,4 µm. Аспирируйте среду для подготовки с верхней части инсерта для культивирования клеток с помощью пастеровской пипетки.

Поместите вкладыш в шестилуночный планшет для культивирования, содержащий 1 мл культуральной среды в каждой лунке. Инкубируйте шестилуночные планшеты при 35 °C в полностью увлажненной атмосфере с 5% CO2 и заменяйте культуральную среду каждые два дня. Через шесть дней культивирования для тканей крысы или через 14 дней для тканей мыши воспалительные реакции, связанные с самой процедурой нарезки, исчезают.

Теперь можно приступать к проведению экспериментов. Репрезентативные результаты исследований нейропротекторного действия. На части изображения A показаны неповрежденные срезы OHSC, которые выдерживались в культуральной среде в течение девяти дней in vitro без какой-либо обработки и служили в качестве контрольных срезов.

Как было подтверждено с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, в контрольных OHSC наблюдалась хорошая сохранность нейронов. Микроглиальные клетки, положительные по Isolectin B4, локализовались преимущественно в молекулярном и плексиформном слоях и имели разветвленный фенотип. В гранулярном слое зубчатой извилины было обнаружено лишь очень небольшое количество микроглиальных клеток, положительных по Isolectin B4, и практически отсутствовали ядра, положительные по Propidium Iodide.

Другой набор OHSC, показанный на части B изображения, содержали в культуральной среде в течение шести дней, после чего наносили повреждение 50 µM NMDA в течение четырех часов. Затем их снова содержали в культуральной среде в течение трех дней. После повреждения NMDA наблюдалось массивное накопление активированных Isolectin B4-положительных микроглиальных клеток, прикрепившихся к месту нейронального повреждения во всех слоях зубчатой извилины.

Количественный анализ показал, что в гранулярном слое зубчатой извилины количество микроглиальных клеток, положительных по изолектину B4, было выше в поврежденных срезах OHSC по сравнению с контрольными условиями. Аналогичным образом, число дегенерирующих нейронов, положительных по пропидия иодиду, было значительно увеличено в гранулярном слое срезов, поврежденных NMDA. Примеры результатов исследований инвазии опухоли.

На всех изображениях представлены результаты инвазии опухоли SS с использованием OHSC, полученные с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Красным цветом обозначена цитоархитектура OHSC, зеленым — опухолевые клетки. На изображении A показан типичный характер инвазии клеток глиобластомы U138 при продолжительности инвазии в четыре дня.

Можно наблюдать четкие сферические обособленные опухоли; структура OHSC кажется неповрежденной, с отчетливо видимыми зубчатой извилиной и Cornu Ammonis. На изображении B показан другой характер инвазии, возникший при воздействии клеток глиобластомы LN229 через четыре дня. В данном случае отдельные опухоли невозможно четко различить из-за образовавшейся сети, покрывающей большую часть OHSC, хотя цитоархитектоника остается сохранной с недеформированными зубчатой извилиной и Cornu Ammonis.

Кроме того, можно сделать вывод, что клетки LN229 более инвазивны, чем клетки U138. На изображениях C и D представлены результаты инвазии опухоли клеток LN229 через четыре дня. Слева видно, что опухолевая масса занимает почти все поле зрения.

На изображении D показано соответствующее окрашивание пропидиййодидом. На данном срезе цитоархитектоника более не сохранена, так как Cornu Ammonis больше не виден, а зубчатая извилина также деформирована. Возможной причиной такого результата мог быть OHSC, который не был полностью сохранен в начале этого эксперимента, слишком большое количество введенных опухолевых клеток или слишком длительное время инвазии, что привело к наблюдаемой потере структуры.

Таким образом, результаты такого рода инвазии следует отбросить. Органотипические культуры срезов гиппокампа представляют собой очень хорошую модель in vitro, отражающую физиологию мозга с сохранными нейронными связями. Поскольку в рамках одной модели можно получить несколько культур срезов, это позволяет тестировать множество условий на ткани одного животного, и такие результаты обладают высокой воспроизводимостью.

Благодаря высокой степени доступности, органотипические культуры срезов гиппокампа отлично подходят для множества типов экспериментов. К ним относятся электрофизиологические исследования и изучение нейрогенеза, а также эксперименты по нейропротекции, инвазии опухолей и взаимодействию опухолевых клеток со здоровой тканью мозга.