Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Общая цель этого протокола быстрого посмертного культивирования клеток заключается в создании устойчивых клеточных культур диффузной внутренней понтинной глиомы, полученных от пациента, чтобы облегчить проведение экспериментов, необходимых для понимания и, в конечном итоге, разработки эффективных методов лечения DIPG. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о фундаментальной биологии и терапевтических стратегиях диффузной внутренней понтинной глиомы, например, о том, работают ли определенные препараты в различных культурах, полученных от пациентов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет непосредственно изучать биологию клеток, полученных от пациента.

Применение этого метода распространяется и на терапию DIPG, поскольку он позволяет тестировать различные терапевтические стратегии для разных генетических подтипов заболевания. Хотя этот метод может дать представление о DIPG, он также может быть применен к другим заболеваниям, таким как другие детские глиомы высокой степени злокачественности, глиобластомы взрослых или другие опухоли центральной нервной системы. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что трудно получить и быстро эффективно обработать образцы для вскрытия.

Перед подготовкой образца простерилизовать капюшон для культуры тканей вместе с бритвенными лезвиями, изогнутыми гемостатами и другими нестерильными инструментами под ультрафиолетовым светом в течение одного часа, а все последующие действия выполнить в стерильных условиях. Затем перенесите ткань в высокостенную чашку для клеточных культур размером 100 на 20 миллиметров. Удалите среду, оставшуюся после транспортировки, и замените ее 10–15 миллилитрами среды для холодных культур.

Затем, используя изогнутые гемостатики для захвата лезвия бритвы, мелко измельчите ткань, удаляя кровеносные сосуды или мозговые оболочки. Конечные фрагменты ткани должны быть меньше одного миллиметра. После этого переложите ткань в чистую коническую трубку объемом 50 миллилитров

Вымойте чашку для клеточных культур еще пятью миллилитрами холодной питательной среды и перенесите образец в коническую пробирку. Повторите этот шаг промывки по мере необходимости, чтобы перенести оставшуюся ткань. С помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров осторожно растирайте образец четыре-пять раз.

Дайте более крупным фрагментам ткани осесть на дно трубки. При необходимости кратковременно центрифугируйте образец в течение одной минуты. Чтобы собрать диссоциированную фракцию, удалите надосадочную жидкость и фильтрат через 100-микронный фильтр в новую 50-миллилитровую коническую трубку с маркировкой «Механическая диссоциация».

Переверните фильтр над исходной конической трубкой и промойте ее питательной средой для восстановления фрагментов ткани. Затем центрифугируйте механическую фракцию диссоциации в течение пяти минут. После этого удаляют надосадочную жидкость из гранулированной фракции механической диссоциации и повторно суспендируют ткань в холодных питательных средах.

Если в конической трубке механической диссоциации находится более пяти миллилитров ткани, разделите ткань на другие 50-миллилитровые конические трубки таким образом, чтобы ни в одной трубке не было более пяти миллилитров ткани. Затем храните механически диссоциированную фракцию на льду до этапа центрифугирования градиента сахарозы. При этой процедуре коническая трубка, содержащая оставшиеся фрагменты ткани, центрифугируется в течение пяти минут.

После этого удалите надосадочную жидкость и добавьте предварительно подогретый ферментативный раствор для пищеварения, чтобы на каждый миллилитр ткани приходилось пять миллилитров раствора для пищеварения. Затем запечатайте коническую крышку пробирки лабораторной пленкой и инкубируйте реакцию на ротаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации тщательно измельчите образцы.

Используя серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, пипетируйте образец вверх и вниз от шести до восьми раз, избегая образования чрезмерных пузырьков воздуха. Затем добавьте наконечник для пипетки объемом 1000 микролитров на конец пипетки и растирайте образец еще шесть-восемь раз. Дайте оставшимся кусочкам осесть на дно пробирки.

Затем удалите и отфильтруйте надосадочную жидкость с еще взвешенными клетками через 100-микронный фильтр в новую 50-миллилитровую коническую пробирку с надписью «Ферментативная диссоциация» и храните ее на льду. После этого центрифугируйте пробирку ферментативной диссоциации в течение пяти минут, и продолжайте центрифугирование градиентом сахарозы. Если образец все еще находится во взвешенном состоянии в растворе, центрифугируйте его в течение пяти минут.

Далее удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ткани в 20 миллилитрах холодного HBSS без кальция и магния. Затем, доведите объем до 25 миллилитров с помощью холодного HBSS. Медленно добавьте 25 миллилитров 1,8 молярного раствора сахарозы, и переверните трубку для перемешивания.

Это приводит к градиенту сахарозы 0,9 моляра. Затем центрифугируйте образец без перерыва в течение 10 минут. Осторожно отсасывайте остатки миелина в как можно большем количестве раствора сахарозы.

Затем промойте образец, добавив 30 миллилитров холодного HBSS без кальция и магния, и аккуратно перемешайте. После этого центрифугируйте его в течение пяти минут. При этой процедуре удалите надосадочную жидкость для стирки.

Добавьте пять миллилитров буфера для лизиса ACK и аккуратно повторно суспендируйте клеточную гранулу, вращая пробирку в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем угасите лизис, добавив 30 миллилитров холодного HBSS без кальция и магния. Впоследствии центрифугируйте его в течение пяти минут.

Повторно суспендируйте конечную клеточную гранулу в 10-15 миллилитрах теплого полного TSM с факторами роста и количественно измерьте плотность жизнеспособных клеток на гемоцитометре, используя исключение трипанового синего. После этого перенесите окончательную клеточную суспензию в новую колбу для культур T75. Добавляйте дополнительные факторы роста через день для поддержания общего уровня факторов роста и следите за развитием нейросфер опухолевых клеток.

Вот различные примеры того, как образцы могут выглядеть от ранних стадий культивирования до долговечной культуры. Первоначально пластинчатые и ранние культуры часто не содержат большого количества сохранившихся клеток. Кроме того, ранние клеточные кластеры часто не демонстрируют степень контрастности, обычно связанную с нейросферами.

Тем не менее, первоначальное прохождение этих клеточных кластеров в сочетании с обратной фильтрацией клеточных кластеров может изолировать здоровые опухолевые клетки, способные образовывать сферы. Фильтрат обычно содержит остатки мусора. Эти образцы, полученные от пациента, затем могут быть сохранены в культуре для нескольких пассажей.

После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что образец поддерживается при низкой температуре на каждом этапе, кроме ферментативной диссоциации, и свести к минимуму травматическое обращение с образцом. После этой процедуры могут быть проведены дополнительные исследования, такие как скрининг лекарственных препаратов in vitro или ортотопическая ксенотрансплантация, чтобы ответить на последующие вопросы о патобиологии DIPG.

После своего развития этот метод культивирования проложил путь исследователям в области детской нейроонкологии к изучению новых терапевтических направлений для детей с DIPG. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выполнять быстрые протоколы посмертного культивирования клеток на образцах опухолей головного мозга. Не забывайте, что работа с человеческими тканями может быть опасной, и всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты и стерильная техника.