Рекомбинантных α-β - и γ-Synucleins стимулировать активность белка фосфатазы 2A каталитическая субъединица в ячейке бесплатные анализы
13 августа 2017 г.
Эта публикация представляет протокол показаны как измерить активность рекомбинантных белков фосфатазы 2A каталитическая субъединица (PP2Ac) в ответ на рекомбинантных α-synuclein, β-synuclein или γ-synuclein белков с помощью простой колориметрического анализа. Мы показываем заключений α-synuclein специфичность к PP2Ac в мозг мыши.
Рекомбинантные альфа-, бета- и гамма-синуклеины стимулируют активность каталитической субъединицы протеинфосфатазы 2A в бесклеточных анализах. Здравствуйте, меня зовут Сованарак Лек. Я студент медицинского факультета в Центре медицинских наук Техасского технологического университета в Эль-Пасо, в Школе медицины им. Пола Л. Фостера.
В этом видео я продемонстрирую метод колориметрического анализа протеинфосфатазы с использованием рекомбинантных белков синуклеина. Приготовление буферов и реагентов. Приготовление буфера с p-нитрофенилфосфатом.
Для приготовления 50 мл буфера pNPP растворите Trizma base в 25 мл ультрачистой деионизированной воды в стакане. Добавьте чистый магнитный якорь и поместите стакан на магнитную мешалку. После растворения Trizma при постоянном перемешивании добавьте хлорид кальция.
Доведите pH до 7,0. Перенесите раствор в мерный цилиндр. Доведите общий конечный объем до 50 mils ультрачистой деионизированной водой.
Приготовление раствора малахитового зеленого. Для приготовления раствора малахитового зеленого требуются три компонента: части А, B и С. Раствор А представляет собой 4 M раствор соляной кислоты. Раствор B — это смесь молибдата аммония и раствора А. Раствор С — это 0,045% раствор оксалата малахитового зеленого.
Для приготовления раствора D смешайте одну часть B с тремя частями C в соотношении 1:3. Перемешивайте в течение одного часа при комнатной температуре. В завершение профильтруйте раствор D через мембрану с размером пор 22 micrums и храните при температуре четырех градусов Celsius.
Беречь от света. Приготовление активатора. Активатор представляет собой 1% раствор Tween 20.
Добавьте 10 µL Tween 20 в 990 µL сверхчистой деионизированной воды. Перемешайте на вортексе до полного растворения Tween 20. Приготовление рабочего раствора малахитового зеленого с Tween 20.
Добавьте активатор к раствору D в соотношении 1:100. Приготовление треонинового фосфопептида. Для приготовления стокового раствора pT с концентрацией 2 mM добавьте 550 microliters сверхчистой деионизированной воды к одному milligram pT.
Перемешивайте на вортексе до полного растворения фосфопептида. Поместите на лед для немедленного использования. Храните избыточные аликвоты pT при температуре -20 °C.
Приготовление синуклеина. Ресуспендируйте 1 мг синуклеина в сверхчистой деионизированной воде до конечной концентрации 1 мг/мл. Осторожно перемешайте на вортексе до полного растворения.
Используйте немедленно, а неиспользованные аликвоты храните при температуре -80 °C. Приготовление стандартов фосфатов. Шаг 1 приготовления стандартов фосфатов.
Для приготовления 1 мМ стокового раствора фосфата растворите фосфат калия в ультрачистой деионизированной воде в стакане с магнитной мешалкой. Перенесите раствор в мерный цилиндр и доведите конечный объем до 100 мл. Полученный раствор имеет концентрацию 10 мМ.
Профильтруйте весь раствор через фильтр 22 мкм с помощью большого шприца. Разведите полученный раствор в пропорции от 1:100 для приготовления 1 мМ раствора фосфата, который будет использоваться в качестве стандартов для анализа. Шаг два приготовления фосфатных стандартов.
Добавьте соответствующее количество фосфата и ультрачистой деионизированной воды в пробирки объемом 1,5 мл согласно таблице. В результате будут получены пробирки с содержанием фосфата 150, 300, 600, 1 200 и 2 400 pmol. Храните аликвоты при температуре -20 °C.
Анализ активности PP2A. Подготовьте реакционную смесь для анализа PP2A в пробирках объемом 1,5 мл на льду. Добавьте 43 µL буфера pNPP.
Добавьте 1 µL рекомбинантного человеческого PP2Ac. Добавьте синуклеин и инкубируйте смесь PP2A и синуклеина в течение 30 минут на нутаторе при температуре 4 °C. Затем добавьте 16 µL 2mM pT.
Инкубируйте в течение 10 минут при 30 °C на водяной бане. В планшет с плоским дном на 96 лунок добавьте по 25 µL каждого стандарта фосфата в двух повторах, от низкой до высокой концентрации. Пипетируйте по 24 µL каждого образца анализа PP2A в двух повторах в тот же 96-луночный планшет со стандартами.
Перенесите по 75 µL раствора D, содержащего Tween 20, в каждую пробу и стандарт. После добавления MGT в лунках при наличии свободных фосфатов произойдет изменение цвета. Проведите фотометрический анализ.
Проведите анализ на спектрофотометре, настроенном на 630 нанометров. Репрезентативные результаты. Здесь представлен репрезентативный анализ PP2A и график, демонстрирующий стандартную кривую.
Слева представлены стандарты фосфата. Чем выше содержание фосфата в лунках, тем темнее оттенок зеленого цвета. Справа находится PP2A, которая была инкубирована с альфа-, бета- или гамма-синуклеинами при различных молярных концентрациях.
Более высокие концентрации оказались более эффективными для стимуляции активности каталитической субъединицы PP2A. Здесь представлена графическая зависимость активности PP2A в ответ на варьирование концентраций альфа-синуклеина, бета-синуклеина и гамма-синуклеина. Альфа-синуклеин, бета-синуклеин и гамма-синуклеин являлись значимыми стимуляторами активности PP2A при концентрации от 1 до 2 µM.
Только альфа-синуклеин и бета-синуклеин в концентрации 0,5 micromolar являлись значимыми стимуляторами активности PP2A. На рисунке 3 показано взаимодействие PP2Ac с эндогенными синуклеинами в мозге мыши. На панели A в качестве положительного контроля представлены рекомбинантные альфа-, бета- и гамма-синуклеины.
На панели B коиммунопреципитация была проведена с использованием антител 1D6, специфичных к PP2Ac; при этом осаждались PP2Ac, а также значительное количество взаимодействующего альфа-синуклеина, в то время как бета-синуклеин практически не осаждался. Гамма-синуклеин при коиммунопреципитации вместе с PP2Ac не выявлялся. Данные коиммунопреципитации позволяют предположить, что альфа-синуклеин является эндогенным модулятором PP2Ac in vivo.
Мы хотим поблагодарить всех, кто помог нам в создании этого видео. Итак, в заключение: Рут Перес. Сонаварак Лек.
Хавьер Варгас. Желаю вам больших успехов. Всего доброго и удачи.
Обзор
В данной публикации представлен протокол измерения активности рекомбинантной каталитической субъединицы протеинфосфатазы 2A (PP2Ac) в ответ на воздействие рекомбинантных белков α-синуклеина, β-синуклеина или γ-синуклеина с использованием колориметрического анализа. Результаты указывают на специфичность α-синуклеина по отношению к PP2Ac в мозге мыши.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Протеинфосфатаза 2A (PP2A) представляет собой критически важный фермент, участвующий в различных клеточных процессах.
- Синуклеины — это семейство белков, вовлеченных в развитие нейродегенеративных заболеваний.
- Понимание взаимодействия между синуклеинами и PP2A может дать представление об их роли в функционировании нейронов.
- Колориметрические методы анализа эффективны для измерения активности ферментов in vitro.
Цель исследования
- Разработать протокол для оценки активности PP2Ac в присутствии синуклеинов.
- Оценить специфичность α-synuclein по отношению к PP2Ac.
- Предоставить детальную методику для исследователей в данной области.
Используемые методы
- Приготовление буферов и реагентов для колориметрического анализа.
- Инкубация PP2Ac с различными концентрациями синуклеинов.
- Измерение ферментативной активности с помощью спектрофотометра.
- Коиммунопреципитация для оценки взаимодействий в образцах мозга мыши.
Основные результаты
- Все три синуклеина (α, β, γ) стимулировали активность PP2Ac при определенных концентрациях.
- α-синуклеин продемонстрировал самую высокую специфичность и интенсивность взаимодействия с PP2Ac.
- Коиммунопреципитация указала на то, что α-синуклеин является основным эндогенным модулятором PP2Ac.
- Колориметрические изменения коррелировали с уровнями фосфата в анализе.
Выводы
- Разработанный протокол эффективен для изучения активности PP2Ac.
- α-синуклеин является значимым модулятором PP2Ac in vivo.
- Данное исследование расширяет понимание взаимодействий синуклеинов в нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
В данном исследовании разработан бесклеточный анализ для оценки модуляции активности PP2Ac синуклеинами, что предоставляет инструментальный механизм для валидации мишеней в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Демонстрируя, что все три изоформы синуклеина способны стимулировать PP2Ac in vitro, данный метод позволяет проверять гипотезы о консервативной функциональной гомологии и ее значении для снижения рисков при разработке путей терапии. Данные коиммунопреципитации дополнительно уточняют специфичность мишени, выделяя α-synuclein в качестве эндогенного модулятора in vivo, что помогает приоритизировать терапевтические гипотезы и уменьшить механистическую неопределенность на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы относительно взаимодействий между синуклеином и PP2Ac при нейродегенерации.
- Научная ценность: Способствует снижению биологических рисков путем выяснения того, вызваны ли наблюдаемые эффекты прямой модуляцией фермента или косвенными путями.
- Научная ценность: Облегчает оценку достоверности мишени путем сравнения изоформ-специфической активности в контролируемой воспроизводимой системе.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированный количественный показатель (высвобождение фосфата с помощью анализа с малахитовым зеленым) для оценки влияния соединений на активность PP2Ac.
- Практическая ценность: Используются рекомбинантные белки и определенные буферы для обеспечения воспроизводимости анализа в различных лабораториях и в ходе кампаний по скринингу.
- Практическая ценность: Позволяет подготавливать валидированные биологические инструменты (например, кривые «доза-эффект») для последующей оценки соединений и подтверждения хитов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает результаты исследований in vitro с эндогенными взаимодействиями, наблюдаемыми в мозге мыши, обеспечивая трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации.
- Научная ценность: Помогает снизить риски при выборе стратегий воздействия на мишень, позволяя отличить неспецифическую активность in vitro от селективной модуляции in vivo.
- Практическая ценность: Помогает в выборе доклинической модели, указывая, какие изоформы синуклеина с наибольшей вероятностью взаимодействуют с PP2Ac в физиологических условиях.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный анализ вписывается в континуум ранних этапов поиска, поддерживая валидацию мишени и идентификацию ведущих соединений путем предоставления количественных данных о механизме действия, которые позволяют принимать решения о продолжении или прекращении разработки до значительных инвестиций в оптимизацию соединений.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов, обеспечивая дозозависимое измерение активации PP2Ac изоформами синуклеина.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной подготовки реагентов и колориметрического сигнала, совместимого с платиновыми форматами.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения фосфатов, что дает возможность сравнивать силу действия и эффективность модуляторов в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклиническими работами, подтверждая, что наблюдаемые эффекты in vitro соответствуют эндогенным взаимодействиям в тканях головного мозга.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для оценки влияния модуляторов на PP2Ac, применимую не только к синуклеинам, но и к другим регуляторным белкам или малым молекулам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов в отношении модуляции мишеней за счет предоставления прямых количественных данных о ферментативной активности.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации и воспроизводимости благодаря детальному описанию приготовления реагентов и определенным условиям инкубации.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения зависимости от косвенных или корреляционных биомаркеров.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе механистических доказательств активации сигнального пути.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области биохимии белков и методов ферментативного анализа, включая работу с рекомбинантными белками и определение фосфорилирования.
- Необходимо наличие спектрофотометрического оборудования с возможностью измерения абсорбции при 630 nm и систем инкубации с контролем температуры.
- Требуется стандартизация подготовки реагентов между исследовательскими группами (например, раствора малахитового зеленого, буфера pNPP) для обеспечения воспроизводимости анализа.
- При применении анализа в не-нейрональных модельных системах или при использовании альтернативных источников PP2Ac следует учитывать необходимость адаптации методики.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость использования свежих фосфопептидных субстратов и строгий контроль температуры на этапах инкубации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Title
0:33
Preparation of Buffers and Reagents
0:38
Preparing p-Nitrophenol Phosphate (pNPP) Buffer
1:21
Preparing Malachite Green Solution
2:21
Preparation of Activator
2:42
Preparing Malachite Green + Tween 20 (MGT) Working Solution
2:58
Preparing Threonine Phosphopeptide (pT)
3:31
Synuclein Preparation
3:59
Preparing Phosphate Standards
4:45
Phosphate Standards Step 2
5:17
PP2A Activity Assay
6:42
Photometric Analysis
6:53
Representative Results
9:01
Conclusion
