Рекомбинантных α-β - и γ-Synucleins стимулировать активность белка фосфатазы 2A каталитическая субъединица в ячейке бесплатные анализы

Рекомбинантные альфа-, бета- и гамма-синуклеины стимулируют активность каталитической субъединицы протеинфосфатазы 2A в бесклеточных анализах. Здравствуйте, меня зовут Сованарак Лек. Я студент медицинского факультета в Центре медицинских наук Техасского технологического университета в Эль-Пасо, в Школе медицины им. Пола Л. Фостера.

В этом видео я продемонстрирую метод колориметрического анализа протеинфосфатазы с использованием рекомбинантных белков синуклеина. Приготовление буферов и реагентов. Приготовление буфера с p-нитрофенилфосфатом.

Для приготовления 50 мл буфера pNPP растворите Trizma base в 25 мл ультрачистой деионизированной воды в стакане. Добавьте чистый магнитный якорь и поместите стакан на магнитную мешалку. После растворения Trizma при постоянном перемешивании добавьте хлорид кальция.

Доведите pH до 7,0. Перенесите раствор в мерный цилиндр. Доведите общий конечный объем до 50 mils ультрачистой деионизированной водой.

Приготовление раствора малахитового зеленого. Для приготовления раствора малахитового зеленого требуются три компонента: части А, B и С. Раствор А представляет собой 4 M раствор соляной кислоты. Раствор B — это смесь молибдата аммония и раствора А. Раствор С — это 0,045% раствор оксалата малахитового зеленого.

Для приготовления раствора D смешайте одну часть B с тремя частями C в соотношении 1:3. Перемешивайте в течение одного часа при комнатной температуре. В завершение профильтруйте раствор D через мембрану с размером пор 22 micrums и храните при температуре четырех градусов Celsius.

Беречь от света. Приготовление активатора. Активатор представляет собой 1% раствор Tween 20.

Добавьте 10 µL Tween 20 в 990 µL сверхчистой деионизированной воды. Перемешайте на вортексе до полного растворения Tween 20. Приготовление рабочего раствора малахитового зеленого с Tween 20.

Добавьте активатор к раствору D в соотношении 1:100. Приготовление треонинового фосфопептида. Для приготовления стокового раствора pT с концентрацией 2 mM добавьте 550 microliters сверхчистой деионизированной воды к одному milligram pT.

Перемешивайте на вортексе до полного растворения фосфопептида. Поместите на лед для немедленного использования. Храните избыточные аликвоты pT при температуре -20 °C.

Приготовление синуклеина. Ресуспендируйте 1 мг синуклеина в сверхчистой деионизированной воде до конечной концентрации 1 мг/мл. Осторожно перемешайте на вортексе до полного растворения.

Используйте немедленно, а неиспользованные аликвоты храните при температуре -80 °C. Приготовление стандартов фосфатов. Шаг 1 приготовления стандартов фосфатов.

Для приготовления 1 мМ стокового раствора фосфата растворите фосфат калия в ультрачистой деионизированной воде в стакане с магнитной мешалкой. Перенесите раствор в мерный цилиндр и доведите конечный объем до 100 мл. Полученный раствор имеет концентрацию 10 мМ.

Профильтруйте весь раствор через фильтр 22 мкм с помощью большого шприца. Разведите полученный раствор в пропорции от 1:100 для приготовления 1 мМ раствора фосфата, который будет использоваться в качестве стандартов для анализа. Шаг два приготовления фосфатных стандартов.

Добавьте соответствующее количество фосфата и ультрачистой деионизированной воды в пробирки объемом 1,5 мл согласно таблице. В результате будут получены пробирки с содержанием фосфата 150, 300, 600, 1 200 и 2 400 pmol. Храните аликвоты при температуре -20 °C.

Анализ активности PP2A. Подготовьте реакционную смесь для анализа PP2A в пробирках объемом 1,5 мл на льду. Добавьте 43 µL буфера pNPP.

Добавьте 1 µL рекомбинантного человеческого PP2Ac. Добавьте синуклеин и инкубируйте смесь PP2A и синуклеина в течение 30 минут на нутаторе при температуре 4 °C. Затем добавьте 16 µL 2mM pT.

Инкубируйте в течение 10 минут при 30 °C на водяной бане. В планшет с плоским дном на 96 лунок добавьте по 25 µL каждого стандарта фосфата в двух повторах, от низкой до высокой концентрации. Пипетируйте по 24 µL каждого образца анализа PP2A в двух повторах в тот же 96-луночный планшет со стандартами.

Перенесите по 75 µL раствора D, содержащего Tween 20, в каждую пробу и стандарт. После добавления MGT в лунках при наличии свободных фосфатов произойдет изменение цвета. Проведите фотометрический анализ.

Проведите анализ на спектрофотометре, настроенном на 630 нанометров. Репрезентативные результаты. Здесь представлен репрезентативный анализ PP2A и график, демонстрирующий стандартную кривую.

Слева представлены стандарты фосфата. Чем выше содержание фосфата в лунках, тем темнее оттенок зеленого цвета. Справа находится PP2A, которая была инкубирована с альфа-, бета- или гамма-синуклеинами при различных молярных концентрациях.

Более высокие концентрации оказались более эффективными для стимуляции активности каталитической субъединицы PP2A. Здесь представлена графическая зависимость активности PP2A в ответ на варьирование концентраций альфа-синуклеина, бета-синуклеина и гамма-синуклеина. Альфа-синуклеин, бета-синуклеин и гамма-синуклеин являлись значимыми стимуляторами активности PP2A при концентрации от 1 до 2 µM.

Только альфа-синуклеин и бета-синуклеин в концентрации 0,5 micromolar являлись значимыми стимуляторами активности PP2A. На рисунке 3 показано взаимодействие PP2Ac с эндогенными синуклеинами в мозге мыши. На панели A в качестве положительного контроля представлены рекомбинантные альфа-, бета- и гамма-синуклеины.

На панели B коиммунопреципитация была проведена с использованием антител 1D6, специфичных к PP2Ac; при этом осаждались PP2Ac, а также значительное количество взаимодействующего альфа-синуклеина, в то время как бета-синуклеин практически не осаждался. Гамма-синуклеин при коиммунопреципитации вместе с PP2Ac не выявлялся. Данные коиммунопреципитации позволяют предположить, что альфа-синуклеин является эндогенным модулятором PP2Ac in vivo.

Мы хотим поблагодарить всех, кто помог нам в создании этого видео. Итак, в заключение: Рут Перес. Сонаварак Лек.

Хавьер Варгас. Желаю вам больших успехов. Всего доброго и удачи.