Быстрое и рафинированное CD11b Магнитная изоляция первичной микроглии с повышенной чистоты и универсальности

Общей целью выделения магнитной микроглии CD11b является достижение высокой чистоты конечного выхода постнатальной микроглии за относительно короткий период времени с целью проведения разносторонних экспериментов in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как сигнальные механизмы, относящиеся к нервному воспалению. Основное преимущество этого метода перед доступными в настоящее время методами заключается в том, что выделение занимает около 30 минут, без ущерба для чистоты, выхода или жизнеспособности.

Начните с переноса только что обезглавленных голов от одно-двухдневных мышиных детенышей в ламинарный капюшон. Затем используйте 4,5-дюймовые прямые ножницы для микропрепарирования, чтобы сделать небольшой разрез в черепе и мозговых оболочках, вставив кончики в отверстие, образованное обезглавливанием, и разрезав каудаль на ростраль. После того, как вы сделаете надрез, отцейте одно из полушарий в сторону.

Затем используйте пару изогнутых или крючковатых пинцетов, чтобы удалить весь мозг. Перенесите мозг в 50-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА, и инкубируйте в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Промойте мозг свежей средой для роста, добавляя и удаляя среду.

После завершения промывки добавьте два миллилитра питательной среды на каждый мозг и гомогенизируйте, растирая мозг. Когда мозговая ткань не становится меньше, переходите на пипетку с меньшим отверстием. В конце растирания, когда суспензия прозрачна и не имеет видимых кусков, пропустите суспензию через клеточное сетчатое фильтр толщиной 70 микрон, чтобы создать одну клеточную культуру.

Затем пипетку от восьми до девяти миллилитров питательной среды в колбы T75, по две колбы на мозг, и добавьте миллилитр гомогената мозга в каждую колбу. Выращивайте клетки до изоляции на шестнадцатый день. Через шестнадцать дней переложите питательную среду из колбы в свежую 50-миллилитровую трубку.

Добавьте три миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА в каждую колбу T75. Затем встряхните колбы в течение пяти минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Центрифугируйте питательную среду в 0,4 раза г в течение пяти минут.

После встряхивания в течение пяти минут добавьте минимум четыре миллилитра центрифугированной питательной среды, чтобы остановить реакцию трипсина ЭДТА, и растирайте, чтобы убедиться, что все клетки были отделены. Затем пропустите клетки через 70-микромолярный клеточный фильтр для создания одной клеточной культуры. Выполните подсчет клеток, а затем вращайте вниз со скоростью 0,4 g в течение пяти минут.

Далее возьмите пятимиллилитровую полистирольную трубку, добавьте один миллилитр рекомендуемой среды, и отметьте мениск. Добавьте рекомендуемую среду до 2,5 миллилитров, и отметьте этот мениск тоже. Затем удалите среду и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах рекомендуемой среды.

Переложите эту смесь в пятимиллилитровую полистирольную трубку, а затем разведите до отметки в один миллилитр. Затем добавьте 50 микролитров крысиной сыворотки на каждый один миллилитр взвешенных клеток, и выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре. Во время инкубации приготовьте отборочный коктейль, смешав 25 микролитров компонента А и 25 микролитров компонента В. По истечении пяти минут добавьте 50 микролитров отборочного коктейля в клетки и инкубируйте еще пять минут при комнатной температуре.

Закручивайте микросферы в течение 45 секунд. Затем добавьте 80 микролитров микросфер на один миллилитр образца, и выдержите три минуты при комнатной температуре. Далее добавьте рекомендуемую среду до отметки 2,5 миллилитра на пенополистирольную трубку.

Поместите трубку в магнитный держатель на три минуты при комнатной температуре. После инкубации медленно вылейте среду в 15-миллилитровую полистирольную трубку, все еще находящуюся в магните. Повторите магнитную сепарацию еще три раза, каждый раз добавляя рекомендуемую среду до отметки 2,5 миллилитров.

После последнего магнитного разделения добавьте три миллилитра питательной среды, и подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток. Поместите клетки в пластины, покрытые поли-D-лизином, для лечения. Положите отрицательную фракцию из 15-миллилитровой пробирки, которая в основном содержит астроциты, в колбы Т75.

После не менее шести часов инкубации в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия замените всю питательную среду в колбах, содержащую отрицательную фракцию, прежде чем вернуться в инкубатор. На этом изображении показана иммуноцитохимия изолированной культуры микроглии, исследованной на IBA, маркер микроглии в зеленом канале, и GFAP, маркер астроцитов, в красном канале. Окрашивание Хёхста выявляет наличие клеточных ядер.

Отсутствие GFAP-положительных клеток свидетельствует о том, что микроглия, выделенная с помощью набора для отбора CD11b, также обладает высокой чистотой. Эти иммуноблотированные белки из изолированной культуры микроглии были исследованы на GFAP, который выглядит как полоса примерно 51 килодальтона, и IBA1, который выглядит как полоса примерно 15 килодальтон. Бета-актин использовался в качестве средства контроля нагрузки и проявляется примерно в 42 килодальтонах.

Проблема со старым изоляционным комплектом заключалась в том, что флуоресценция ПЭ могла наблюдаться в красном канале, как показано здесь. Модифицированная процедура не производит автофлуоресценции из магнитных шариков, как видно на рисунке красного канала. Микроглия, выделенная с помощью этой процедуры, может быть использована для изучения сигналов.

Вестерн-блоттинг показывает, что Fyn и фосфо-src-тирозин Y416 могут быть обнаружены из микроглии, выделенной с помощью нашего недавно усовершенствованного метода. Отрицательная фракция от разделения микроглии содержит астроциты, которые могут быть использованы для исследований сигналов. Вестерн-блоттинг показывает, что отрицательная фракция содержит GFAP-положительные клетки.

Вестерн-блоттинг показывает, что Fyn и фосфо-src-тирозин Y416 могут быть обнаружены из GFAP-положительных клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как многоканальная флуоресцентная микроскопия, вестерн-блоттинг и количественная ПЦР, чтобы ответить на вопросы, касающиеся экспрессии генов и передачи сигналов белков. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать эту технику быстрой изоляции в целях экспериментов с микроглией.