Быстрое и рафинированное CD11b Магнитная изоляция первичной микроглии с повышенной чистоты и универсальности

Общая цель выделения микроглии с помощью магнитной сепарации по маркеру CD11b заключается в получении конечного выхода постнатальной микроглии высокой степени чистоты за относительно короткий промежуток времени для проведения различных экспериментов in vitro. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, о сигнальных механизмах, имеющих отношение к нейровоспалению. Основным преимуществом этой методики перед существующими способами является то, что процесс выделения занимает примерно 30 минут без потери чистоты, выхода или жизнеспособности клеток.

Начните с переноса свежеотсеченных голов мышат в возрасте одного-двух дней в ламинарный шкаф. Затем с помощью прямых микродиссекционных ножниц длиной 4,5 дюйма сделайте небольшой разрез черепа и мозговых оболочек, введя кончики ножниц в отверстие, образовавшееся при декапитации, и выполнив разрез в направлении от каудального к ростральному. После выполнения разреза отодвиньте одно из полушарий в сторону.

Затем с помощью изогнутого или крючковидного пинцета извлеките весь мозг. Перенесите мозг в пробирку объемом 50 мл, содержащую 2 мл 0,25% трипсин-ЭДТА, и инкубируйте в течение 15 минут на водяной бане при 37 °C. Промойте мозг свежей ростовой средой, добавляя и удаляя её.

После завершения промывок добавьте по 2 мл ростовой среды на каждый мозг и гомогенизируйте образец путем тритурации ткани мозга. Если ткань мозга перестает уменьшаться в объеме, перейдите на пипетку с меньшим отверстием. По окончании тритурации, когда суспензия станет однородной и в ней не будет видно фрагментов ткани, профильтруйте ее через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм для получения культуры единичных клеток.

Затем перенесите пипеткой от восьми до девяти миллилитров ростовой среды в колбы T75 (по две колбы на один мозг) и добавьте в каждую колбу один миллилитр гомогената мозга. Культивируйте клетки до момента изоляции на шестнадцатый день. По истечении шестнадцати дней перенесите ростовую среду из колбы в новую пробирку объемом 50 мл.

Добавьте по три миллилитра 0,25% trypsin EDTA в каждый флакон T75. Затем встряхивайте флаконы в течение пяти минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Центрифугируйте питательную среду при 0,4 ×g в течение пяти минут.

После встряхивания в течение пяти минут добавьте не менее четырех миллилитров центрифугированной культуральной среды, чтобы остановить реакцию трипсина-ЭДТА, и проведите тритурацию, чтобы убедиться, что все клетки отделились. Затем пропустите клетки через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм для получения суспензии одиночных клеток. Выполните подсчет клеток, после чего центрифугируйте при 0,4 ×g в течение пяти минут.

Затем возьмите полистирольную пробирку объемом 5 мл, добавьте 1 мл рекомендуемой среды и отметьте уровень мениска. Долейте рекомендуемую среду до отметки 2,5 мл и также отметьте этот мениск. Затем удалите среду и ресуспендируйте осадок в 500 µL рекомендуемой среды.

Перенесите эту смесь в полистирольную пробирку объемом 5 мл, затем доведите объем до отметки 1 мл. Затем добавьте 50 мкл сыворотки крысы на каждый 1 мл суспензии клеток и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Во время инкубации приготовьте селективный коктейль, смешав 25 мкл компонента А и 25 мкл компонента В. По истечении пяти минут добавьте к клеткам 50 мкл селективного коктейля и инкубируйте еще пять минут при комнатной температуре.

Перемешайте микросферы на вортексе в течение 45 секунд. Затем добавьте 80 µL микросфер на 1 mL образца и инкубируйте в течение трех минут при комнатной температуре. После этого добавьте рекомендованную среду до отметки 2,5 mL на полистирольной пробирке.

Поместите пробирку в магнитный держатель на три минуты при комнатной температуре. После инкубации медленно слейте среду в полистирольную пробирку объемом 15 мл, по-прежнему находящуюся в магните. Повторите магнитную сепарацию еще три раза, каждый раз добавляя рекомендуемую среду до отметки 2,5 мл.

После последнего магнитного разделения добавьте три миллилитра ростовой среды и подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток. Для проведения экспериментов высейте клетки в планшеты, покрытые поли-D-лизином. Отрицательную фракцию из 15-миллилитровой пробирки, которая состоит преимущественно из астроцитов, высейте во флаконы T75.

После инкубации в течение не менее шести часов в термостате при 37 °C замените всю ростовую среду в колбах с негативной фракцией, прежде чем вернуть их в термостат. На данном изображении представлена иммуноцитохимия изолированной культуры микроглии с окрашиванием на IBA (маркер микроглии) в зеленом канале и GFAP (маркер астроцитов) в красном канале. Окрашивание Hoechst выявляет наличие клеточных ядер.

Отсутствие GFAP-положительных клеток свидетельствует о том, что микроглия, выделенная с помощью набора для положительной селекции CD11b, также обладает высокой степенью чистоты. Белки из выделенной культуры микроглии, разделенные методом иммуноблоттинга, были проанализированы на наличие GFAP, который проявляется в виде полосы приблизительно 51 кДа, и IBA1, который проявляется в виде полосы приблизительно 15 кДа. Бета-актин использовался в качестве контроля загрузки и проявляется при приблизительно 42 кДа.

Проблема старого набора для выделения заключалась в том, что флуоресценция PE могла наблюдаться в красном канале, как показано здесь. Модифицированная процедура не вызывает автофлуоресценции магнитных бусин, что видно в красном канале здесь. Микроглия, выделенная с помощью этой процедуры, может быть использована для изучения механизмов передачи сигналов.

Вестерн-блот-анализ показывает, что Fyn и фосфо-src тирозин Y416 могут быть обнаружены в микроглии, выделенной с помощью нашего усовершенствованного метода. Отрицательная фракция после сепарации микроглии содержит астроциты, которые могут быть использованы для изучения передачи сигналов. Вестерн-блоттинг показывает, что отрицательная фракция содержит GFAP-положительные клетки.

Вестерн-блот-анализ показывает, что Fyn и фосфо-src тирозин Y416 могут быть обнаружены в GFAP-положительных клетках. После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как многоканальная флуоресцентная микроскопия, вестерн-блоттинг и количественная ПЦР, для получения ответов на вопросы, касающиеся экспрессии генов и белковой сигнализации. После просмотра этого видео вы должны иметь четкое представление о том, как использовать этот метод быстрой изоляции для проведения экспериментов с микроглией.