Последовательные соли экстракции для анализа массовых Chromatin привязки свойств Chromatin изменения комплексы
2 октября 2017 г.
Последовательные добыча соли хроматина связаны белков является полезным инструментом для определения свойств привязки крупных белковых комплексов. Этот метод может использоваться для оценки роли отдельных подразделений или домены в общей схожести белкового комплекса для массового хроматина.
Общая цель процедуры последовательной экстракции соли состоит в том, чтобы охарактеризовать профили связывания белка с объемным хроматином и оценить, как изменяется связывание при манипуляциях с белком или его окружением. Этот метод измеряет относительное сродство эпигенетических регуляторов к хроматину и может быть использован для оценки того, как эти взаимодействия изменяются под воздействием генетических, химических и экологических манипуляций. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является быстрым и недорогим способом оценки профилей связывания хроматин-связывающих белков.
Люди, плохо знакомые с хроматином, часто борются с иммунопреципитацией хроматина, или ChIP. Последовательная экстракция соли — это старый метод, который даже неопытные ученые могут использовать для ответа на многие из тех же вопросов. Чтобы начать процедуру, соберите 8 000 000 клеток из каждой интересующей клеточной линии.
Промойте каждый образец клетки пятью миллилитрами ледяного PBS дважды. Ресуспендируйте каждый образец и один миллилитр гипотонического буфера с ингибиторами протеазы. Перенесите клеточные суспензии в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.
Вращайте суспензии сверху вниз в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия, а затем центрифугируйте суспензию в течение пяти минут при той же температуре при 6000 G. Выбросьте надосадочную жидкость. Оснастите микропипетку с наконечником объемом в один миллилитр.
Добавьте в гранулу 200 микролитров бессолевого модифицированного рипа-буфера с ингибиторами протеазы. Постучите кончиком пипетки по дну пробирки микроцентрифуги, чтобы втянуть гранулу в наконечник. Проведите пипеткой гранулу вверх и вниз 15 раз.
Образец должен стать густым и липким по мере разрушения гранул. Таким образом гомогенизируйте каждый образец и инкубируйте образцы на льду в течение трех минут. Затем центрифугируйте образцы при температуре 6500 G при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех минут.
Перенесите надосадочную жидкость в чистые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. К каждой грануле добавьте 200 миллилитров модифицированного рипабуфера со 100 миллимолярным хлоридом натрия и ингибиторами протеазы. Проведите пипеткой гранулу вверх и вниз 15 раз.
Если изначально трудно втянуть гранулу в наконечник пипетки, постучите кончиком по дну трубки. Повторите этот процесс для каждого образца и инкубируйте образцы на льду в течение трех минут. Центрифугируйте образцы при температуре 6500 G при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех минут.
Перенесите надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Продолжайте экстрагировать образцы в модифицированные буферные растворы с увеличением концентрации хлорида натрия. Когда гранула больше не остается на дне пробирки, поместите ее в крышку пробирки центрифуги перед сцеживанием надосадочной жидкости.
После серийной экстракции соли для каждого образца добавьте 70 миллилитров красителя, в четыре раза превышающего загрузку белка, в каждую из пяти надосадочных фракций. Загрузите по 30 микролитров каждой фракции в акриламидный гель SDS. Проведите стандартный вестерн-блоттинг путем переноса белков на мембрану и окрашивания соответствующими первичными антителами.
Инкубируйте блот во вторичных антителах, меченных инфракрасным красителем, и визуализируйте блот. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для расчета интенсивности канала для каждой концентрации соли. Постройте график зависимости интенсивности полосы от концентрации соли, чтобы определить характер элюирования интересующего белка.
Последовательная солевая экстракция белков ARID1a и Polybromo 1 показала последовательное элюирование с концентрациями соли 200 и 300 миллимоляров соответственно. Непоследовательная экстракция солью тех же белков показала менее стабильные результаты. Время инкубации должно быть оптимизировано для каждого исследуемого белка.
Таким образом, SSE был использован для изучения профилей элюирования после различной длины инкубации. Активатор транскрипции, Polybromo 1, показал аналогичные профили элюирования при инкубации в течение трех минут и 10 минут. Транскрипционному репрессору, репрессивному комплексу Polycomb 1, на который указывает BMI1, потребовалось более трех минут, чтобы освободиться от хроматина.
Белок-белковые взаимодействия были исследованы путем изучения изменения профилей элюирования. В присутствии ингибитора, бромдомена, содержащего белок 4, указывали при более низких концентрациях солей, чем без ингибитора. Различия в паттернах гистонов наблюдались при обработке клеток ингибитором гистондеацетилазы, изменяющим ландшафт хроматина.
Изменения в связывании белков, когда клетки испытывали геномный стресс, также отражались в профилях элюирования. В данном случае увеличение концентрации соли, необходимой для элюирования, позволяет предположить, что Polybromo 1 более тесно связывается с хроматином после повреждения ДНК доксорубицином. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-три часа, если она выполнена правильно.
Пытаясь пройти эту процедуру, не забывайте быть как можно более последовательным в обращении с каждым образцом. Эта процедура может быть использована на начальных этапах исследования для выяснения механизма и регуляции хроматин-связывающего белка. Это экономит время и деньги на ненужных полногеномных исследованиях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Процедура последовательной экстракции солями предназначена для характеристики профилей связывания белков с общим хроматином и оценки того, как эти связи изменяются под воздействием различных манипуляций. Данный метод особенно полезен для оценки аффинности эпигенетических регуляторов к хроматину.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология хроматина
- Белковые взаимодействия
- Эпигенетика
Теоретические основы
- Последовательная солевая экстракция — это метод изучения белков, связывающихся с хроматином.
- Он представляет собой быстрый и экономичный способ, альтернативный иммунопреципитации хроматина (ChIP).
- Данный метод доступен даже для исследователей без большого опыта.
- Он позволяет оценить, как белковые взаимодействия меняются под воздействием генетических, химических и факторов окружающей среды.
Цель исследования
- Для характеристики профилей связывания хроматин-связывающих белков.
- Для оценки влияния различных манипуляций на связывание белков.
- Для предоставления простого и доступного метода исследователям в области изучения хроматина.
Используемые методы
- Сбор 8 000 000 клеток каждой интересующей клеточной линии.
- Последовательная солевая экстракция для выделения белков, связанных с хроматином.
- Оценка аффинности связывания белков с хроматином.
- Анализ изменений профилей связывания при различных условиях.
Основные результаты
- Метод позволяет эффективно характеризовать профили связывания белков.
- Он демонстрирует, как факторы окружающей среды могут изменять аффинность связывания.
- Результаты указывают на полезность данной методики как для опытных, так и для начинающих исследователей.
- Метод дает представление о взаимодействиях эпигенетических регуляторов с хроматином.
Выводы
- Последовательная солевая экстракция является ценным инструментом для изучения взаимодействий хроматина.
- Данный метод эффективен и доступен для различных исследовательских целей.
- Он углубляет понимание динамики связывания белков в биологии хроматина.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для данной отрасли
Последовательная солевая экстракция (Sequential Salt Extraction, SSE) представляет собой быстрый и экономичный метод оценки аффинности белков, связывающихся с хроматином, что позволяет проводить валидацию мишеней на ранних этапах поиска лекарственных средств, направленных на эпигенетическую регуляцию. Количественно оценивая, как генетические, химические или средовые воздействия изменяют взаимодействия белков с хроматином, SSE способствует механистическому снижению рисков при изучении хроматин-модифицирующих комплексов до перехода к ресурсозатратным анализам. Этот подход повышает прогностическую достоверность при идентификации ведущих соединений-кандидатов, позволяя отличить эффекты прямого связывания от косвенных клеточных ответов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет измерить изменения относительной аффинности связывания при потере субъединиц комплекса или инактивации доменов, что проясняет функциональный вклад отдельных белков во взаимодействие с хроматином.
- Научная ценность: Позволяет анализировать профили элюции при повышении концентрации соли для дифференциации специфического связывания с хроматином от неспецифических ассоциаций, что снижает количество ложноположительных результатов при валидации мишеней.
- Практическая ценность: Позволяет специалистам, не имеющим глубокого опыта в проведении ChIP, получать количественные данные о связывании, что ускоряет проверку гипотез на ранних этапах исследования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать воспроизводимые профили элюции, которые служат количественными показателями для скрининга влияния соединений на изменения ландшафта хроматина.
- Практическая ценность: использует стандартное оборудование для вестерн-блоттинга и анализа изображений, что способствует стандартизации анализа в разных лабораториях и снижает техническую вариабельность.
- Практическая ценность: требует только базового оборудования для центрифугирования и электрофореза, что облегчает внедрение метода в каскады скрининга эпигенетических модуляторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: связывает изменения в состоянии хроматина (например, под воздействием ингибиторов HDAC) с изменениями в связывании белков, что способствует проведению механистических исследований с использованием биомаркеров в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Научная ценность: позволяет оценить сдвиги в связывании при геномном стрессе (например, при повреждении ДНК, индуцированном доксорубицином), что дает информацию для создания прогностических моделей взаимодействия с мишенью в патофизиологических условиях.
- Практическая ценность: дополняет клеточные и биохимические анализы, обеспечивая ортогональную валидацию непрерывности взаимодействия с хроматином на этапах от поиска до доклинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
SSE вписывается в континуум поиска новых соединений — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, служа механистическим связующим звеном между биохимическими анализами связывания и клеточными фенотипическими показателями в программах по эпигенетике.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез путем количественной оценки того, как сложные изменения влияют на связывание с хроматином, что позволяет уточнить сигнальные пути и снизить биологические риски при выборе эпигенетических мишеней.
- Скрининг: предоставляет профили элюции, зависящие от концентрации соли, в качестве количественных данных для сравнения изменений состояния хроматина, вызванных соединениями, в ходе различных кампаний по скринингу.
- Аналитика: генерирует данные об интенсивности полос в зависимости от концентрации соли, обеспечивая расчет сдвигов аффинности связывания, что служит основой для обсуждения взаимосвязи «структура-активность».
- Трансляционные исследования: связывает изменения связывания in vitro с модификациями ландшафта клеточного хроматина, что при сочетании с функциональными показателями способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой стандартизированную недорогую методику, применимую к множеству мишеней в хроматине, что способствует повторному использованию платформы в конвейерах разработки эпигенетических лекарственных препаратов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней, позволяя отличить прямое связывание с хроматином от косвенных клеточных эффектов с помощью контролируемого вымывания солью.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимые количественные профили связывания с использованием широко доступного лабораторного оборудования, что способствует стандартизации работы между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: снижает зависимость от низкопроизводительного метода ChIP при первичной оценке связывания, что повышает эффективность использования ресурсов на ранних этапах проектов по эпигенетике.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию мишеней комплексов, модифицирующих хроматин, с учетом рисков, основываясь на количественной устойчивости связывания к воздействиям внешней среды.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области биохимии хроматина и количественного анализа вестерн-блоттинга для точной интерпретации профиля элюции.
- Необходим доступ к центрифугам с охлаждением, микроцентрифужным пробиркам и стандартному оборудованию для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
- Требуется соблюдение стандартизированных протоколов сбора и лизиса клеток для минимизации вариабельности между образцами и обеспечения сопоставимых результатов экстракции солью.
- Необходима оптимизация времени инкубации для каждого целевого белка, так как кинетика высвобождения связей различается для разных хроматин-модифицирующих комплексов.
- Метод ограничен сравнением относительного сродства; для определения абсолютных констант связывания требуется валидация с помощью ортогональных биофизических методов.
