Последовательные соли экстракции для анализа массовых Chromatin привязки свойств Chromatin изменения комплексы

Общая цель процедуры последовательной экстракции соли состоит в том, чтобы охарактеризовать профили связывания белка с объемным хроматином и оценить, как изменяется связывание при манипуляциях с белком или его окружением. Этот метод измеряет относительное сродство эпигенетических регуляторов к хроматину и может быть использован для оценки того, как эти взаимодействия изменяются под воздействием генетических, химических и экологических манипуляций. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является быстрым и недорогим способом оценки профилей связывания хроматин-связывающих белков.

Люди, плохо знакомые с хроматином, часто борются с иммунопреципитацией хроматина, или ChIP. Последовательная экстракция соли — это старый метод, который даже неопытные ученые могут использовать для ответа на многие из тех же вопросов. Чтобы начать процедуру, соберите 8 000 000 клеток из каждой интересующей клеточной линии.

Промойте каждый образец клетки пятью миллилитрами ледяного PBS дважды. Ресуспендируйте каждый образец и один миллилитр гипотонического буфера с ингибиторами протеазы. Перенесите клеточные суспензии в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Вращайте суспензии сверху вниз в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия, а затем центрифугируйте суспензию в течение пяти минут при той же температуре при 6000 G. Выбросьте надосадочную жидкость. Оснастите микропипетку с наконечником объемом в один миллилитр.

Добавьте в гранулу 200 микролитров бессолевого модифицированного рипа-буфера с ингибиторами протеазы. Постучите кончиком пипетки по дну пробирки микроцентрифуги, чтобы втянуть гранулу в наконечник. Проведите пипеткой гранулу вверх и вниз 15 раз.

Образец должен стать густым и липким по мере разрушения гранул. Таким образом гомогенизируйте каждый образец и инкубируйте образцы на льду в течение трех минут. Затем центрифугируйте образцы при температуре 6500 G при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех минут.

Перенесите надосадочную жидкость в чистые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. К каждой грануле добавьте 200 миллилитров модифицированного рипабуфера со 100 миллимолярным хлоридом натрия и ингибиторами протеазы. Проведите пипеткой гранулу вверх и вниз 15 раз.

Если изначально трудно втянуть гранулу в наконечник пипетки, постучите кончиком по дну трубки. Повторите этот процесс для каждого образца и инкубируйте образцы на льду в течение трех минут. Центрифугируйте образцы при температуре 6500 G при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех минут.

Перенесите надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Продолжайте экстрагировать образцы в модифицированные буферные растворы с увеличением концентрации хлорида натрия. Когда гранула больше не остается на дне пробирки, поместите ее в крышку пробирки центрифуги перед сцеживанием надосадочной жидкости.

После серийной экстракции соли для каждого образца добавьте 70 миллилитров красителя, в четыре раза превышающего загрузку белка, в каждую из пяти надосадочных фракций. Загрузите по 30 микролитров каждой фракции в акриламидный гель SDS. Проведите стандартный вестерн-блоттинг путем переноса белков на мембрану и окрашивания соответствующими первичными антителами.

Инкубируйте блот во вторичных антителах, меченных инфракрасным красителем, и визуализируйте блот. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для расчета интенсивности канала для каждой концентрации соли. Постройте график зависимости интенсивности полосы от концентрации соли, чтобы определить характер элюирования интересующего белка.

Последовательная солевая экстракция белков ARID1a и Polybromo 1 показала последовательное элюирование с концентрациями соли 200 и 300 миллимоляров соответственно. Непоследовательная экстракция солью тех же белков показала менее стабильные результаты. Время инкубации должно быть оптимизировано для каждого исследуемого белка.

Таким образом, SSE был использован для изучения профилей элюирования после различной длины инкубации. Активатор транскрипции, Polybromo 1, показал аналогичные профили элюирования при инкубации в течение трех минут и 10 минут. Транскрипционному репрессору, репрессивному комплексу Polycomb 1, на который указывает BMI1, потребовалось более трех минут, чтобы освободиться от хроматина.

Белок-белковые взаимодействия были исследованы путем изучения изменения профилей элюирования. В присутствии ингибитора, бромдомена, содержащего белок 4, указывали при более низких концентрациях солей, чем без ингибитора. Различия в паттернах гистонов наблюдались при обработке клеток ингибитором гистондеацетилазы, изменяющим ландшафт хроматина.

Изменения в связывании белков, когда клетки испытывали геномный стресс, также отражались в профилях элюирования. В данном случае увеличение концентрации соли, необходимой для элюирования, позволяет предположить, что Polybromo 1 более тесно связывается с хроматином после повреждения ДНК доксорубицином. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-три часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь пройти эту процедуру, не забывайте быть как можно более последовательным в обращении с каждым образцом. Эта процедура может быть использована на начальных этапах исследования для выяснения механизма и регуляции хроматин-связывающего белка. Это экономит время и деньги на ненужных полногеномных исследованиях.