Генерация IPSC, полученные из органоидов человеческого мозга Модели раннего развития нервной системы Расстройства

Общая цель данного протокола по созданию органоидов человеческого мозга, полученных из иПСК, заключается в моделировании ранних нарушений нейроразвития у человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития человеческого мозга, такие как роль синтесом и ресничек в неонейрогенезе и первичной микроцефалии. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой надежную и быструю модель для получения воспроизводимых результатов с использованием органоидов мозга, полученных из иПСК пациентов.

Процедуру продемонстрирует Элке Габриэль, постдок из моей лаборатории в Центре молекулярной медицины, Кельн. Для начала процедуры соберите нейросферы с помощью микропипетки на 200 µL, используя наконечник с отверстием 2 мм, предварительно обрезанный стерильными ножницами. Затем поместите нейросферы на парафиновую пленку в чашке объемом 100 mL на расстоянии примерно 5 мм друг от друга.

Осторожно удалите как можно больше оставшейся среды. Затем добавьте каплю матрицы EHS на каждую отдельную нейросферу. Инкубируйте капли матрицы EHS с нейросферами в течение 15 минут при 37 °C.

После этого осторожно промойте нейросферы на парафиновой пленке, промывая их средой для культивирования нейросфер. Затем инкубируйте нейросферы в течение следующих четырех дней, добавив 2 мл свежей среды для нейросфер на второй день. В ходе данной процедуры добавьте в каждую колбу с мешалкой через боковые отводы по 100 мл среды для мозговых органоидов.

Предварительно прогрейте среду в инкубаторе при 37 °C в течение не менее 20 минут. Затем убедитесь, что все нейросферы отделены друг от друга. Если две или более сферы соединены матриксом EHS, разделите их, разрезав соединяющий матрикс скальпелем.

Установите программу перемешивания на 25 RPM. Осторожно перенесите нейросферы, встроенные в матрикс EHS, в колбы с перемешивающим устройством, содержащие 100 milliliters среды для органоидов. После этого расставьте колбы на платформе с магнитной мешалкой в инкубаторе на 14 дней при 37 degrees celsius.

Это нулевой день культивирования органоидов. Заменяйте среду раз в неделю, удаляя половину объема среды и добавляя такое же количество свежей среды. На данном этапе соберите органоиды из культуры в колбе с перемешивателем на 14-й день с помощью предварительно обрезанного микропипеточного наконечника объемом 1 мл.

Поместите все органоиды в чашку диаметром 60 мм и однократно промойте их 5 мл теплого DMEM F12 в течение трех минут. Затем подготовьте пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл теплого 4% PFA. Поместите каждый органоид в отдельную пробирку и фиксируйте их в течение 30–60 минут при комнатной температуре.

После этого с помощью инокуляционной петли извлеките органоиды. Затем удалите PFA и дважды промойте фиксированные органоиды в течение 10 минут каждый раз, используя один миллилитр PBS. Впоследствии храните органоиды в одном миллилитре PBS при температуре четыре градуса цельсия в течение до 7 дней для дальнейшего использования.

Для заливки органоидов перед криосекционированием удалите PBS и добавьте в каждую пробирку 1 milliliter 30% раствора сахарозы для дегидратации органоидов перед их криозаморозкой. После добавления раствора сахарозы органоиды должны плавать на поверхности. Храните органоиды в растворе сахарозы в течение ночи при температуре four degrees celsius.

К следующему дню органоиды должны опуститься на дно пробирки. После этого заполните виниловую форму для образцов 400 миллилитрами состава OCT. С помощью инокуляционной петли поместите органоид в центр формы.

Маркируйте край формы названием образца. Затем заморозьте форму с органоидом при температуре -80 °C до проведения криосекции. После этого обработайте стеклянные криоподложки 0,1% PLL и PBS в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем дайте предметным стеклам высохнуть в течение трех часов. Храните стекла при температуре 4 °C и перед использованием доведите их до комнатной температуры. После этого выполните срезы криозамороженных органоидов толщиной от 20 до 50 мкм на стеклах для криостата с ПЛЛ-покрытием.

Дайте срезам высохнуть в течение одного часа при комнатной температуре и храните их при температуре -80 °C до дальнейшей обработки. Иммунофлуоресцентные изображения криосрезов органоидов, демонстрирующих типичную VZ и примитивную корковую пластинку. VZ простирается от апикальной стороны к базальной стороне.

Обратите внимание, что клетки в пределах VZ имеют палисадообразные ядра, что указывает на то, что они являются радиальными глиальными клетками. На правой панели показано иммунофлуоресцентное окрашивание Nestin-положительных NPC в VZ и TUJ1-положительных нейронов в примитивной кортикальной пластинке. Здесь представлены два примера VZ, окрашенных с помощью PVIM и ARL 13B.

Области, отмеченные белыми квадратами, увеличены. Апикальные радиальные глиальные клетки, делящиеся на апикальной стороне VZ, являются PVIM-положительными. Плоскость деления клетки в анафазе расположена горизонтально по отношению к линии поверхности просвета, которая отмечена окрашиванием ARL 13B.

После освоения эта методика может быть выполнена за 23 дня при условии правильного соблюдения протокола. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости периодического контроля качества и проверки культур на наличие микроплазмы. Разработка этого метода открыла исследователям в области нейробиологии развития возможность изучать механизмы нейрогенеза в органоидах человеческого мозга.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать органоиды человеческого мозга из различных линий иПСК, включая клеточные линии пациентов с нарушенными клеточными функциями.