Созревание стволовых клеток человека, полученных кардиомиоцитов в Biowires Использование электрической стимуляции

Общая цель этой процедуры заключается в использовании контролируемых трехмерных методов культивирования клеток в электростимуляции для стимулирования созревания человеческих эмбрионов и кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инженерии сердечной ткани, в том числе о том, как различные параметры электростимуляции или продолжительность времени влияют на функцию сердечных клеток и состояние созревания. Конечным результатом являются инженерные сердечные ткани человека повышенной зрелости.

Применение этого метода распространяется на диагностические приложения, такие как тестирование безопасности и эффективности новых лекарств, поскольку кардиомиоциты со зрелыми характеристиками, такими как электрический прогресс, скорее всего, будут служить более точными моделями сердечных клеток человека в исследованиях по скринингу лекарств. Соедините мономер PDMS и отвердитель в соотношении 10:1 и хорошо перемешайте. Дайте ему застыть в течение пяти минут, чтобы он дегазировался.

Затем загрузите чашку Петри, содержащую шаблон для биопроволочной матрицы, смесью PDMS. Постарайтесь свести к минимуму образование пузырьков воздуха. Затем высушите PDMS при температуре 70 градусов Цельсия в течение двух часов.

Затем восстановите затвердевшую форму, сначала используя острое лезвие по краям, а затем сняв ее. Затем обрежьте излишки PDMS и соберите все шаблоны в стерилизационный мешок. Пар автоматически клавирует шаблоны при температуре 121 градус Цельсия в течение 20 минут.

А затем загрузить каждый шаблон в стерильную чашку Петри под вентиляцию шкафа биобезопасности. Теперь для каждого шаблона с помощью пинцета вмонтируйте кусочек стерильного шелкового шовного материала 6.0 в паз, охватывающий весь канал. После этого шаблоны готовы к засеиванию ячеек.

Шов будет служить шаблоном для формирования 3D-конструкций, которые выстраиваются по оси шва, имитируя форму сердечных волокон. Для каждой камеры сделайте пару прямоугольных деталей из поликарбоната, которые послужат каркасом для камеры электростимуляции. По центральной линии каждого изделия просверлите два отверстия шириной три миллиметра, расположенные на расстоянии двух сантиметров друг от друга.

Для каждой камеры готовят по два угольных стержня длиной 1,5 сантиметра. Примерно в 3 миллиметрах от конца каждого штанги сверлите отверстие шириной в один миллиметр. Затем проденьте каждое отверстие в платиновую проволоку и оберните один конец проволоки вокруг стержня.

Далее для каждой камеры вставляем по два стержня между двумя кусками поликарбоната, делая каркас. Затем налейте около двух миллилитров PDMS в лунку из шести лунок и поместите раму в лунку с PDMS, погрузив дно рамки. Отверждайте PDMS при температуре 70 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы PDMS закрепил раму.

Затем снимите готовую камеру с пластиной с прикрепленным PDMS. Чтобы проверить работу собранной камеры, подключите платиновые провода к батарее и с помощью вольтметра проверьте, пропускается ли электричество через стержни. Теперь переложите функциональные камеры в стерилизационный мешок и используйте 20 минут паровой стерилизации при 121 градусе Цельсия, чтобы подготовить их к культивированию клеток.

Для приготовления геля необходимо предварительно охладить все компоненты геля на льду перед тем, как смешать их в стерильной пробирке. Обязательно добавьте коллаген и дополнительный клеточный матрикс в последнюю очередь и смешайте компоненты с помощью пипетирования. К клеткам относятся кардиомиоциты, дифференцированные из плюрипотентных стволовых клеток человека.

Соберите клетки и для каждого растения-препарата биопроволоки приготовьте 3,5 микролитра коллагенового геля, содержащего полмиллиона клеток. Теперь с помощью наконечника для пипетки P10 загрузите примерно четыре миллилитра суспензии в шаблон канала длиной 0,5 сантиметра в каждой чашке. При необходимости отрегулируйте положение шва с помощью стерильных щипцов, чтобы он полностью растянулся.

После посева клеток обязательно всегда повторно суспендируйте смесь гелевых клеток перед приемом автоклава, чтобы получить стабильные результаты. После загрузки каналов накройте дно чашки стерильным PBS, следя за тем, чтобы не касаться геля. Это позволит гарантировать, что биопровода не обезвоживаются во время полимеризации.

После инкубации биопроводов при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут замените PBS питательной средой, достаточной для покрытия клеток. Обычно достаточно 12 миллилитров. Затем заквашивайте блюдо в течение недели, заменяя среду через день.

В шкаф биологической безопасности добавьте два миллилитра PBS в каждую лунку шестилуночной пластины, в которой будет размещена камера электрического стимулятора. Затем с помощью стерильного пинцета аккуратно поместите автоклавные устройства в лунки. Оказавшись на месте, выбросьте PBS и замените его пятью миллилитрами теплой среды, которая должна полностью покрыть угольные стержни.

Перед культивированием клеток в течение 24 часов наблюдайте за сократительной способностью кардиомиоцитов в ответ на электрическую стимуляцию, чтобы убедиться, что клетки улавливают электрический стимул и реагируют сокращениями. Далее поместите биопровода в камеру электростимулятора и сориентируйте каналы перпендикулярно угольным стержням. Оттяните платиновые проволоки в сторону от пластины, а затем накройте пластины.

Подключите провода к электростимулятору. Настройте стимулятор на подачу двухфазных импульсов в одну миллисекунду с частотой в один герц и с частотой три вольта на сантиметр. Затем перенесите препараты в электростимуляторе в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия.

Увеличивайте частоту стимуляции постепенно каждые 24 часа с одного герца в нулевой день до шести герц в шестой день. В течение этой недели культуры меняйте среду через день. И ежедневно наблюдайте за сократительной способностью кардиомиоцитов.

После семи дней предварительного посева в биопроволочных клетках переформировали гель вокруг шва. Клетки собираются вдоль оси шва, образуя выровненную сердечную ткань. Клетки, экспрессирующие сердечные сократительные белки, показали саркомерную полосатость в сократительном аппарате, а их миофибриллы были выровнены вдоль оси шва.

Клетки биопроволоки демонстрировали более низкие темпы пролиферации, чем клетки эмбриоидных тел. Обработка кальция была значительно улучшена в кардиомиоцитах, культивируемых в биопроводах. Лечение кофеином вызывало резкое высвобождение кальция из крестцово-плазматического ретикулума.

Такие транзиенты были обнаружены только в стимулированных клетках. Также наблюдалась значительно более высокая частота стимуляции в зависимости от амплитуды высвобождения кальция. Кроме того, кардиомиоциты, культивируемые в биопроводах, показали улучшенную плотность тока hERG и внутреннего выпрямителя по сравнению с культивированием в эмбриоидных тельцах, которая была дополнительно усилена электрической стимуляцией.

Улучшенный внутренний выпрямительный ток соответствовал повышенной экспрессии калиевого выпрямляющего канала jean, KCN J2. Автоматизм, способность к спонтанному биению, была значительно выше у кардиомиоцитов, полученных из эмбриоидного тела, по сравнению с контролируемыми биопроводами. Контроль показал автоматичность, сравнимую с получением биопроволоки по схеме шести герц. После освоения настройка биопроводов может быть выполнена за полдня.

Настройка электростимуляции займет пару часов, а окончательных результатов можно будет достичь уже через две недели. При проведении этой процедуры важно помнить, что кардиомиоциты, дифференцированные из разных клеточных линий или по разным протоколам, могут незначительно различаться по своей зрелости и чистоте. Следовательно, может потребоваться оптимизация экспериментальных параметров, таких как скорость стимуляции ваших клеток.

После этой процедуры другие условия, включая изменение клеточного состава и использование мутантных кардиомиоцитов, могут быть оптимизированы, чтобы ответить на ряд дополнительных вопросов.