Упорядочение одноклеточного TCR изоляции и поколения ретровиральных векторов для In Vitro и In Vivo выражение человека TCRs

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как альфа- и бета-репертуар TCR конкретной популяции антигена, а также функциональность TCR человека in vivo. Основными преимуществами данной методики являются относительно высокая эффективность ПЦР-реакции, а также ее совместимость с последующим клонированием TCR. В этом протоколе используется двухэтапная ПЦР для амплификации альфа- и бета-цепей TCR из одной клетки без предварительного знания последовательности TCR.

Первая ПЦР представляет собой мультиплексную реакцию с использованием пула альфа- или бета-вариабельных регионально-специфичных праймеров в сочетании с праймером, специфичным для константной области. Вторая ПЦР представляет собой вложенную реакцию, которая отталкивается от последовательности адаптера, встроенной в пять основных концов продукта ПЦР, а также от внутренней последовательности постоянной области. Эти праймеры также включают уникальные сайты рестрикции в пять основных и три основных конца продукта ПЦР для облегчения последующего клонирования.

После клонирования в вектор матрицы закодированная последовательность TCR является химерной, состоящей из вариабельных областей человека с зеркальными постоянными областями. Химерная конструкция TCR обеспечивает взаимодействие между TCR и зеркальным сигнальным комплексом CD3, что делает этот протокол клонирования TCR совместимым с последующими функциональными исследованиями в зеркальных клеточных линиях и в гуманизированных моделях мышей. Подготовьтесь к сортировке по отдельным клеткам, подготовив реагенты для обратной транскрипции в чистой, свободной от шаблонов области.

Как правило, люди, плохо знакомые с методом ПЦР с использованием одиночных клеток, испытывают трудности из-за низкого уровня шаблона. С другой стороны, чувствительность мультиплексной вложенной ПЦР чувствительна к низким уровням загрязнения матрицы. Поэтому необходимо тщательно очистить участки, в которых вы будете настраивать ПЦР-реакции.

В этой реакции используется смесь трех обратных праймеров, специфичных для постоянной области альфа- и бета-цепей. Приготовьте мастер-смесь для обратной транскрипции, соединив реагенты в резервуаре для дозирования. Чтобы учесть ошибку пипетирования, приготовьте достаточное количество реакционной смеси для десяти дополнительных лунок.

Используйте многоканальный пипетку для дозирования шести микролитров на лунку в 96-луночный ПЦР-планшет. Плотно накройте тарелку уплотнителем и держите тарелку на льду. Подготовьте Т-клетки для сортировки одиночных клеток путем окрашивания клеток антителами к маркерам клеточной поверхности.

Отсортируйте Т-клетки сразу в ячейку, оставив двенадцать строк пустой, что будет служить отрицательным контролем. Заклейте пластину клейкой пленкой и открутите при температуре 1000г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Немедленно запустите реакцию обратной транскрипции.

Если возможно, проведите первую ПЦР-реакцию в тот же день. Для запуска мультиплексной реакции необходимо отдельно смешать мастер-смеси V альфа и V бета ПЦР в резервуарах для дозирования. Держите планшет с кДНК на льду или на холодном блоке.

Перенесите 22,5 микролитра бета-реакции TCR в новую 96-луночную ПЦР-планшет. Затем с помощью многоканального канала перенесите 2,5 микролитра кДНК в ПЦР-планшет. Используйте многоканальный пипетку для дозирования 22,5 микролитров TCR альфа-реакции непосредственно в планшет, содержащий оставшуюся часть кДНК.

Заклейте пластины клеем, аккуратно закрутите и кратковременно закрутите вниз. Запустите первую реакцию ПЦР. Тарелки можно хранить при температуре 20 градусов Цельсия.

На следующий день приготовьте вторую вложенную ПЦР-реакцию. С помощью многоканального дозатора пипетки мастер-смеси для альфа- и бета-реакций TCR по 22,5 микролитра на лунку в два новых 96-луночных ПЦР-планшета. Добавьте шаблон реакции мультиплексной ПЦР в дозе 2,5 микролитра на лунку.

Запечатайте пластины, аккуратно сделайте вихрь и кратковременно закрутите вниз. Оставшаяся первая ПЦР-реакция должна быть запечатана и храниться при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы служить источником резервного шаблона. Проведите вторую реакцию ПЦР.

После завершения второй вложенной ПЦР-реакции выведите пять микролитров реакции на 1%-ный агарозный гель. Включите положительную и отрицательную контрольные скважины. Ожидаемая полоса должна иметь размер около 500 пар оснований.

Очистите оставшуюся часть второй реакции, двадцать микролитров, с помощью набора для очистки ПЦР формата 96 лунок и выполните секвенирование по Сэнгеру. Полученные последовательности TCR могут быть проанализированы с помощью иммуногенетического программного обеспечения, доступного в режиме онлайн. Информация о последовательностях может быть использована для оценки репертуара и клональности популяции Т-клеток.

Парные альфа- и бета-последовательности TCR могут быть использованы в дальнейшем функциональном анализе. Выполните последовательные лигирования TCR beta и TCR alpha в вектор-шаблон. Шаблоны TCR beta и TCR alpha заменяются цепочками, амплифицированными методом ПЦР.

При первом лигировании матричный TCR beta заменяется на амплифицированную ПЦР бета-цепь. После того, как успешная инсеквенция TCR beta была проверена с помощью последовательности тест-дайджеста, замените матрицу TCR альфа на альфа-цепь, амплифицированную ПЦР. HEK293T ячейки используются для тестирования успешного спаривания цепей TCR и экспрессии клеточной поверхности.

HEK293T клетки ко-трансфицируются с вектором TCR, маркированным аметрином, флуоресцентным репортером, и вектором, кодирующим комплекс CD3, меченным GFP. Поверхностная экспрессия химерного TCR проверяется с помощью проточной цитометрии путем окрашивания клеток антимышиным антителом CD3. Уровень поверхностной экспрессии CD3 в клетках, трансфицированных химерной конструкцией TCR, должен быть сопоставим с уровнем экспрессии поверхностного CD3 в клетках, трансфицированных полностью зеркальным контрольным вектором.

Таким образом, мы описали эффективный протокол на основе ПЦР для идентификации и клонирования парных цепочек TCR из одиночных клеток. Мы ожидаем, что это будет ценным инструментом для изучения Т-клеточных реакций человека при аутоиммунных заболеваниях, эпиднадзоре за опухолями и элиминации патогенов. Основным преимуществом описанного здесь протокола ПЦР является его совместимость с последующими исследованиями in vitro и in vivo.