Визуализация ангиогенеза путем микроскопии Multiphoton In Vivo в генетически модифицированных 3D-PLGA/nHAp эшафот подвздошную критических ремонта дефекта кости

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации процесса формирования кровеносных сосудов in vivo в трехмерных скаффолдах в режиме реального времени с помощью мультифотонной микроскопии. Эти измерения позволяют ответить на ключевые вопросы в области регенерации костной ткани, например, как нейтрализовать и стимулировать формирование кровеносных сосудов in vivo в трехмерных скаффолдах в режиме реального времени. Одним из преимуществ данного метода является возможность одновременной нейтрализации CERES, компонентов внеклеточного матрикса и окружающих молекулярных сетей in vivo.

Для начала приготовьте гомогенный раствор, содержащий 20 grams PLGA и 20 milliliters 1, 4 dioxane. Затем добавьте в раствор два грамма порошкообразного nHAP. С помощью магнитной мешалки интенсивно перемешивайте суспензию при 1500 rpm при комнатной температуре в течение 16 hours до образования однородной пасты, которая будет использоваться для печати пористых скаффолдов из PLGA NHAP.

После печати подвергните скаффолды лиофилизации в течение 48 часов для полного удаления растворителя. Затем стерилизуйте их в 75% этаноле в течение одного часа. После этого повторно проведите лиофилизацию для получения нейтрального антисептического материала.

Затем добавьте 4,5 × 10⁵ лентивирусных частиц к каждому скаффолду и оставьте частицы для абсорбции в увлажненном инкубаторе при 37 °C на два часа. После того как лентивирусные частицы абсорбировались на скаффолдах, дважды промойте скаффолды 2 мл PBS, чтобы удалить все несвязавшиеся остатки. Быстро заморозьте промытые скаффолды в жидком азоте.

После повторной лиофилизации храните их при −80 °C для дальнейших исследований. Перенесите 3D-скаффолды, предварительно покрытые 4,5 × 10⁵ лентивирусными частицами, несущими зеленый флуоресцентный белок, в криопробирки объемом 2,0 мл, заполненные 1 мл полной среды DMEM, и инкубируйте их при 37 °C с перемешиванием в течение пяти дней. Каждые 12 часов инкубации отбирайте пробы среды объемом 1 мл, содержащие лентивирусные частицы, высвобожденные из скаффолдов, и заменяйте их 1 мл свежей среды.

Для трансдукции клеток HEK293T сначала удалите среду из клеток HEK293T, культивируемых в 12-луночном планшете, и дважды промойте клетки PBS. Затем добавьте один миллилитр предварительно собранной среды к промытым клеткам HEK293T и инкубируйте планшет в течение 48 часов при 37 °C в увлажненном инкубаторе. После 48 часов инкубации измерьте количество GFB-положительных клеток HEK293T методом проточной цитометрии, чтобы определить число биоактивных лентивирусных частиц.

Для начала случайным образом разделите мышей линии C57BL/6 на три группы по 14 животных в каждой: контрольную группу, группу PH и группу PHp. Выбрейте шерсть на голове мыши, находящейся под наркозом, и продезинфицируйте поверхность йодной настойкой, а затем 75% раствором спирта. Поместите голову мыши в стереотаксический инструмент, рассеките кожу скальпелем, а затем с помощью ножниц сделайте линейный разрез длиной 1 см.

С помощью стерильного ватного тампона соскоблите надкостницу с черепной кости, чтобы обнажить ее поверхность. Затем с левой стороны черепа с помощью трепанационного бора создайте критический дефект диаметром 4 мм. Трансплантируйте скаффолд в область костного дефекта.

С помощью офтальмологического пинцета осторожно закройте область хирургического вмешательства надкостницей. После этого зашейте рану, накладывая по три шва на каждый сантиметр разреза. В завершение введите анальгетик бупренорфин для купирования послеоперационной боли и поместите животное на грелку для поддержания температуры тела до полного пробуждения.

Когда мышь придет в сознание, обеспечьте ее кормом и водой и наблюдайте за ее повседневной активностью до завершения эксперимента. После сборки системы многофотонной микроскопии для визуализации TPEF и SHG настройте фемтосекундный титан-сапфировый лазер на 860 nanometers. Чтобы визуализировать вновь образовавшиеся кровеносные сосуды, введите мыши внутривенно 200 µL раствора декстрана в физиологическом растворе с концентрацией 10 mg/mL, затем, используя стереотаксический прибор, иммобилизуйте анестезированное животное на нагревательной платформе для поддержания температуры тела на уровне 37 °C.

Введите мыши 200 µL физиологического раствора внутрибрюшинно для предотвращения обезвоживания. В завершение обеспечьте животному подачу 3% смеси изофлурана в 100% кислороде для поддержания достаточной анестезии и анальгезии во время визуализации. Для начала визуализации сканируйте пару гальванометров, чтобы создать область выборки размером 512 by 512 µm.

Затем, используя иммерсионный объектив с числовой апертурой NA 1.0 (по воде), сфокусируйте возбуждающий пучок на образце и зарегистрируйте сигнал обратного рассеяния TPEF HSG. Установите поле зрения таким образом, чтобы оно охватывало область нормальной кости и край дефекта в контрольной группе, а при визуализации животных из групп PH или PHp — только имплантированный скаффолд. Затем проведите сканирование пяти различных участков дефекта.

Выполняйте сбор стеков изображений каждые 12 секунд в течение двухчасового периода визуализации. Здесь представлена фотография скаффолда, изготовленного методом 3D-печати, а также микро-КТ изображение, демонстрирующее общую пористость полученного материала. Микропористая структура скаффолда показана на СЭМ-изображении, полученном при 5000-кратном увеличении.

Как показано, клетки HEK293T, обработанные средой, содержащей лентивирусные частицы, высвобожденные из скаффолдов, эффективно экспрессировали зеленый флуоресцентный белок. По данным проточной цитометрии, общее количество высвобожденных частиц достигло примерно 40%. Наиболее выраженный эффект высвобождения наблюдался в течение первых 24 часов исследования и постепенно снижался со временем, что подтверждает сохранение биологической активности лентивирусных частиц, нанесенных на скаффолды, на срок до 96 часов.

Анализ in vivo кровеносных сосудов, сформировавшихся в дефекте кости свода черепа, показал, что новые сосуды, которые не обнаруживались в контрольной группе мышей, были четко видны в группах PH и PHp через восемь недель после трансплантации скаффолда. Кроме того, хотя во многих местах в обеих группах PH и PHp наблюдались отложения коллагена, только в группе PHp было отмечено увеличение количества более мелких сосудов, прорастающих в скаффолды, а общая площадь кровеносных сосудов существенно различалась. После освоения эта методика может быть выполнена за два часа при условии соблюдения всех правил.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости иммобилизации головы мыши, чтобы обеспечить ее неподвижность во время сканирования и избежать появления артефактов. После данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как фотоакустическая визуализация, для получения дополнительных данных, например, изображений глубоких слоев тканей. После разработки эта методика открыла исследователям в области регенерации костной ткани возможность изучения ангиогенеза в трансплантатах.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о методах микрофотонной микроскопии и визуализации образования плазмы в 3D-каркасах in vivo в режиме реального времени.