Визуализация ангиогенеза путем микроскопии Multiphoton In Vivo в генетически модифицированных 3D-PLGA/nHAp эшафот подвздошную критических ремонта дефекта кости

Общая цель этого эксперимента — визуализировать формирование кровеносных сосудов in vivo в трехмерных каркасах в режиме реального времени с помощью многофотонной микроскопии. Эти измерения являются ключевыми вопросами в области генерации костной ткани, например, как нейтрализовать и обмануть in vivo формирование кровеносных сосудов в трехмерных каркасах в режиме реального времени. Одним из преимуществ этой методики является то, что она позволяет одновременно нейтрализовать CERES, внеклеточную метрику и окружающие молекулярные сети in vivo.

Для начала приготовьте однородный раствор, содержащий 20 грамм PLGA и 20 миллилитров 1, 4 диоксана. Затем добавьте в раствор два грамма порошкообразного nHAP. С помощью магнитной мешалки энергично перемешайте суспензию при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 16 часов, чтобы образовалась однородная паста, которая будет использоваться для печати пористых скаффолдов PLGA NHAP.

После печати сублимационную сушку скаффолдов в течение 48 часов, чтобы полностью удалить растворитель. А затем стерилизовать их в 75-процентном этаноле в течение одного часа. После этого очистите их еще раз, чтобы получить нейтральный антисептический материал.

Затем добавьте четыре целых пять десятых по 10 до пятой части чечевичных частиц в каждый каркас и дайте частицам впитаться во влажном инкубаторе, поддерживая температуру 37 градусов по Цельсию в течение двух часов. Теперь, когда частицы лентивируса впитались на каркасах, дважды промойте каркасы двумя миллилитрами PBS, чтобы удалить любые несвязанные остатки. Заморозьте вымытые леса в жидком азоте.

А после еще раз лифализа храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейших исследований. Перенесите 3d скаффолды, ранее покрытые четырьмя целыми пятью десятью десятью десятью до пятой части лентивирусных частиц, несущих зеленый флуоресцентный белок, в два целых целых ноль миллилитровых криогенных флаконов, наполненных одним миллилитром полного DMEM, и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение пяти дней. Каждые двенадцать часов инкубации собирайте по одному миллилитру образцов среды, содержащей чечевичные частицы, высвобождающиеся из каркасов, и заменяйте их одним миллилитром свежей среды.

Чтобы трансдуцировать HEK293T клетки, сначала удалите среду из HEK293T клеток, культивируемых в 12-луночной пластине, и дважды промойте клетки PBS. Затем добавьте один миллилитр собранной ранее среды в промытые HEK293T ячейки и инкубируйте тарелку в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе. После 48 часов инкубации измерьте количество GFB-положительных HEK293T клеток с помощью проточной цитометрии, чтобы определить количество биоактивных лентивирусных частиц.

Для начала случайным образом разделите черную шестерку мышей C57 на три группы лечения: контрольную, PH и PHp по 14 животных в каждой. Побрейте кожу на голове мыши, находящейся под наркозом, и продезинфицируйте поверхность йодной настойкой, а затем 75-процентным спиртовым раствором. Поместите головку мыши в стереотаксический инструмент и измерьте кожу с помощью скальпеля, а затем с помощью ножниц сделайте линейный разрез в один сантиметр.

С помощью стерильного ватного тампона соскребите надкостницу с черепной кости, чтобы обнажить ее поверхность. Затем с левой стороны черепа создайте с помощью трепанного бора дефект критического размера диаметром четыре миллиметра. Пересадите каркас в боковую часть костного дефекта.

С помощью офтальмологических щипцов аккуратно накройте место операции надкостницей. После этого закройте рану, наложив три шва на каждый сантиметр разреза. Наконец, введите обезболивающий бупренорфин для контроля послеоперационной боли и держите животное на грелке, чтобы поддерживать температуру его тела до тех пор, пока оно не проснется.

Когда мышь придет в сознание, обеспечьте ее едой и водой и следите за ее повседневной деятельностью до конца эксперимента. После сборки многофотонной микроскопической системы для визуализации TPEF и SHG настройте фемтосекундный титановый сапфировый лазер на 860 нанометров. Чтобы визуализировать вновь образованные кровеносные сосуды, введите мышке внутривенно 200 микролитров раствора декстрана в солевом растворе с концентрацией 10 миллиграммов на миллилитр, а затем с помощью стереотаксического инструмента обездвижите животное под наркозом на нагревательной пластине, чтобы поддерживать температуру его тела на уровне 37 градусов по Цельсию.

Введите мышь 200 микролитров физиологического раствора внутрибрюшинно, чтобы предотвратить обезвоживание. Наконец, дайте животному трехпроцентную смесь изофлурана со 100-процентным содержанием кислорода для поддержания достаточной анестезии и обезболивания во время визуализации. Чтобы начать визуализацию, отсканируйте пару гальванических зеркал, чтобы создать область выборки размером 512 на 512 микрометров.

Затем с помощью линзы водно-погружного объектива NA в одну точку О сфокусируйте волнующий луч на образце и соберите обратно рассеянный сигнал TPEF HSG. Установите поле зрения таким образом, чтобы оно охватывало нормальный участок кости и край дефекта в контрольной группе, но только имплантированный каркас при визуализации животного из группы PH или PHp. Затем отсканируйте пять различных участков дефекта.

Получайте стеки изображений каждые 12 секунд в течение двух часов. Здесь представлена фотография каркаса, изготовленного с помощью технологии 3D-печати, а также микрокомпьютерная томография, показывающая общую пористость подготовленного материала. Микропористая структура каркаса показана на СЭМ-изображении, полученном при 5000-кратном увеличении.

Как показано, HEK293T клетки, обработанные средой, содержащей лентивирусные частицы, высвобождающиеся из каркасов, эффективно экспрессировали зеленый флуоресцентный белок. По оценкам проточной цитометрии, общее количество высвобождаемых частиц достигало примерно 40 процентов. Наиболее сильный эффект высвобождения наблюдался в течение первых 24 часов исследования и постепенно снижался с течением времени, подтверждая, что лентивирусные частицы, покрытые скаффолдами, сохраняют свою биологическую активность до 96 часов.

Анализ in vivo кровеносных сосудов, образованных в пределах дефекта кости черепной кости, показал, что новые кровеносные сосуды, хотя и не обнаруживаемые в контрольной группе мышей, были четко видны как в группах ЛГ, так и в группах ПГп через восемь недель после трансплантации скаффолда. Кроме того, в то время как в группах ЛГ и ПГп было обнаружено много мест отложения коллагена, только в группе ПГп можно было наблюдать увеличение числа более мелких сосудов, врастающих в скаффолды, и общая площадь кровеносных сосудов значительно отличалась. После освоения этой техники ее можно сделать за два часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать обездвиживать головку мыши, чтобы она оставалась неподвижной во время сканирования, чтобы избежать каких-либо артефактов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фотоакустическая визуализация, чтобы получить дополнительные данные, такие как изображения глубоких тканей. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области регенерации костей к изучению ангиогенеза в трансплантатах.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать in vivo формирование плазмы в 3d скаффолдах в реальном времени, а также микрофотонную микроскопию.