Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

Общая цель этой простой, но эффективной процедуры заключается в выделении и обогащении редких антигенсвязывающих В-клеток из периферической крови человека с использованием магнитных наночастиц для их фенотипического и функционального анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, касающиеся фенотипа и биологии редких антигенсвязывающих В-клеток как до, так и после встречи с антигеном in vivo. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он устраняет проблемы, связанные с геометрией, особенно при использовании стирольной пластины или большого валика.

Кроме того, это устраняет проблемы, связанные со скоростью потока, когда клетки изолируются с помощью проточной цитометрии для выделения редких клеток в довольно больших исходных клеточных популяциях. Сразу после сбора от 30 до 50 миллилитров цельной крови в гепаринизированные пробирки для сбора крови смешайте кровь в соотношении 1:1 со стерильным магнием комнатной температуры и PBS, не содержащим кальция. Затем налейте смесь крови на 10 миллилитров раствора градиента плотности комнатной температуры в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров, используя медленное постоянное давление триггера пипетки.

Разделите ячейки центрифугированием. Отбросьте плазму и содержащий тромбоциты верхний слой и с помощью стерильной пипетки перенесите контейнер с мононуклеарной клеткой в новую стерильную пробирку объемом 50 миллилитров. Наполните пробирку до 50 миллилитров PBS для промывки мононуклеарных ячеек центрифугированием.

Затем повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах свежего PBS для подсчета и повторно суспендируйте клетки в концентрации 1x10^7 клеток на миллилитр в свежем PBS на льду. Чтобы окрашивать элементы для связывания магнитных шариков, сначала перенесите 1-2x10^6 аликвот ячеек в пятимиллилитровые полистирольные трубки для каждой компенсации флуоресценции и контроля флуоресценции минус один, в зависимости от ситуации. Затем соберите оставшуюся часть образца клеток с помощью центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу до концентрации 3-6x10^7 клеток на миллилитр в стерильном фильтрованном холодном буфере FACS.

Разделите клеточный раствор поровну на четыре пробирки FACS на льду и добавьте регант, блокирующий рецептор Fcgamma человека, к этим четырем фракциям экспериментального образца. В конце инкубации со специфическими блокирующими антителами добавляют соответствующие флуоресцентные конъюгированные антитела к окрашиванию клеточной поверхности к клеткам во всех четырех фракциях образца. Затем добавляют соответствующий биотинилированный антиген к фракциям А и D с последующим добавлением достаточного объема немеченого антигена к фракции В таким образом, чтобы большинство рецепторов со сродством по меньшей мере 1x10^6 моляров блокировались.

Инкубируйте все образцы в течение 30 минут на льду с последующей 30-минутной инкубацией фракции B с соответствующим биотинилированным антигеном. В конце инкубации промойте клетки два раза в одном миллилитре ледяного буфера FACS на 5x10^7 клеток. И ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре 2% формальдегида на 5x10^7 клеток на пять минут в темноте на льду.

После фиксации промойте клетки еще два раза, как только что было показано. И ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре свежего ледяного буфера FACS на 5x10^7 клеток. Затем пометьте клетки одним-двумя микрограммами соответствующего вторичного конъюгированного антитела к стрептавидину в течение 20 минут в темноте на льду и промойте клетки еще два раза.

Для обогащения на основе магнитных наночастиц ресуспендируйте фракции клеток A, B и C в одном миллилитре холодного разделительного буфера на 5x10^7 клеток и отфильтруйте клетки через отдельные 40-микролитровые фильтры, чтобы удалить любые комки. Далее добавьте наночастицы флуоресцентного красителя в соответствующей концентрации в течение 10 минут в темноте при четырех градусах Цельсия с вращением и промойте образцы два раза в одном миллилитре холодного буфера разделения. Ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре холодного буфера для разделения на 5x10^7 клеток.

Затем уравновесьте три магнитные колонки на магнитах соответствующего размера с тремя миллилитрами сепарационного буфера каждая, позволив всему объему сепарационного буфера пройти через каждую колонку в контейнер для отходов. Теперь поместите по одной маркированной конической трубке объемом 15 миллилитров под каждую колонку и добавьте ячейки, помеченные магнитными частицами, в соответствующие колонки. Когда весь объем каждой клеточной фракции пройдет через каждую колонку, добавьте три миллилитра свежего ледяного сепарационного буфера в верхнюю часть каждой колонки, собирая стоки в помеченные пробирки.

После того как вторая промывка полностью стечет по колонкам, поместите на лед пробирки с отрицательно отобранными ячейками от каждой фракции и переложите колонки в новые 15 миллилитровые пробирки для каждой фракции. Заполните каждую колонку примерно шестью миллилитрами свежего разделительного буфера и немедленно пропустите буфер через колонки, чтобы собрать магнитно-связанные клетки. Затем соберите как положительные, так и отрицательные клеточные фракции путем центрифугирования и повторно суспендируйте гранулы в соответствующем растворе для запланированного последующего анализа.

На этих графиках частота реактивных В-клеток столбнячного анатоксина у человека, который в последний раз был вакцинирован против столбняка более десяти лет назад, демонстрирует возможность использования этого метода для обогащения клеток, связывающих столбнячный анатоксин, примерно в семь раз с чистотой около 4%. Перед добавлением биотинилированного антигена связывание столбняка с анатоксином снижается на 83%, что свидетельствует о специфичности связывания антигена. Когда биотинилированный антиген исключается из процедуры, только 0,2% В-клеток все еще связываются, предположительно, отражая связывание некоторого антигена, не являющегося столбняком, в абсорбенте.

Эти графики демонстрируют, как частота специфических для столбнячного анатоксина наивных В-клеток из образца крови, взятого через семь дней после бустерной вакцинации здорового субъекта, снижается с 84% до 64% после бустерной вакцинации. В то время как процент популяций памяти и плазмобластов увеличивается с 16% до 36% и от нуля до 40% соответственно. Кроме того, репрезентативные данные ELISPOT из образца периферической крови, полученного через семь дней после бустации у здорового субъекта, иллюстрируют четырехкратное обогащение частоты клеток, секретирующих антитела столбнячного анатоксина, наблюдаемое в выделенных В-клетках, связывающих столбнячный анатоксин.

После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за три-четыре часа со всеми надлежащими элементами управления. Метод может быть совмещен с вторичными анализами, например, переносом клеток в усыновленных реципиентов для последующих исследований судьбы и функции клеток. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять и обогащать редкие антигенсвязывающие В-клетки из периферической крови человека с помощью правильного контроля.