Протокол для характеристики морфологических изменений Сложный Clostridium В ответ на лечение антибиотиками

Общая цель этого метода микробиологической визуализации состоит в том, чтобы предоставить более описательные средства для различения фенотипических эффектов фармакологического лечения. Так что этот метод действительно может помочь в области инфекционных заболеваний. В частности, мы рассматриваем морфологические эффекты некоторых антибиотиков и то, как они убивают C.Difficile.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он сочетает в себе визуализацию с высоким разрешением и методы культивирования клеток in vitro, чтобы обеспечить подробный обзор фармацевтического действия. Применение этого метода может распространяться на терапию инфекции Clostridium difficile, или сокращенно CDI. Причина в том, что этот метод может обеспечить средство для определения того, как антибиотик может быть полезен при лечении CDI.

Хотя этот метод может дать представление о фармакологическом действии, он также может быть применен к другим системам, таким как модель смешанных культур или исследования на животных in vivo. Как правило, люди испытывают трудности с этим новым методом, потому что культивирование C.difficile и работа со сканирующим электронным микроскопом являются сложной задачей. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы пытались различить механизмы действия различных антибиотиков.

Я хотел бы познакомить вас с исследовательской группой, с которой вы сегодня встретитесь. Джахангир Алам – профессор и микробиолог. Он координирует всю лабораторную деятельность, которую вы увидите сегодня.

Таснува Рашид — аспирант лаборатории. Она занимается большой частью повседневной микробиологии. Эжени Бассер является научным сотрудником постдока.

Она действительно научила Таснуву многим навыкам, а также помогает в лаборатории. Брэд Эндрес — еще один постдок в лаборатории. Он будет проводить много микроскопии с помощью Лонг Чанга.

Чтобы подготовить изоляты окружающей среды в стерильных перчатках, используйте предварительно стерилизованную ватную марлю для протирания поверхности любой интересующей области, такой как пол, дверь, ручка или полка. Затем поместите тампон в стерилизованную пробирку. Меняйте перчатки между образцами.

Чтобы получить клинические изоляты, используйте петлю инокуляции, чтобы поместить от 10 до 100 миллиграммов клинических образцов кала на цефокситин, циклосерин, фруктозозу, агар, или CCFA, и интубировать образцы в строгих анаэробных условиях в течение 48-72 часов. Храните изолированные колонии поголовья C.Difficile в криопробирках при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа. Обогатите образцы мазков из окружающей среды инфузией мозга сердца или бульоном BHI 05% таурохолата натрия и поместите образцы в анаэробную камеру при температуре 37 градусов Цельсия на пять дней.

Центрифугируйте один миллилитр культуры в 10 000 раз больше G и используйте 100 микролитров этанола для повторного суспендирования гранулы. Поместите 50 микролитров ресуспендированных клеток на планшеты CCFA и инкубируйте культуры в анаэробной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40-48 часов. Храните изолированные колонии C.difficile в криопробирках при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа.

Используйте реагент для агглютинации латекса, или ПЦР, для тестирования предполагаемых колоний C.difficile. Выращивайте очищенные экологические или клинические штаммы C.difficile на кровяных агаровых планшетах в анаэробной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. Используйте петлю для посева, чтобы взять одну изолированную колонию и перенести ее в пять миллилитров среды BHI в 15-миллилитровой пробирке.

Затем выращивают культуру в анаэробной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. С помощью свежих, предварительно восстановленных BHIS с добавлением таурохолата натрия и соответствующей концентрации антибиотика разбавляют предкультуры от 1 до 100 до примерно 10 до 6 КОЕ на миллилитр. С помощью пипетки соберите образец объемом в один миллилитр в каждой временной точке и планшете или намажьте небольшую аликвоту на кровяную агаровую пластину.

Инкубируйте планшет в течение 48 часов в анаэробной камере при температуре 37 градусов Цельсия и подсчитайте полученное количество колоний для определения КОЕ. Соберите по одному миллилитру клеток из каждой точки времени в микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте при 10 000 G в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и используйте PBS для промывания клеток.

Снова прокрутите образцы и выбросьте надосадочную жидкость. Затем используйте один миллилитр 4%-ного параформальдегида для повторного разбавления клеток и инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение одного часа. После повторного вращения образцов и выброса надосадочной жидкости используйте дистиллированную воду для двукратной промывки клеток, прежде чем повторно разбавить клетки в 100 микролитрах дистиллированной воды.

Регулируйте объем в зависимости от мутности раствора. Промаркировав покровные листки, добавьте на них 40 микролитров образца. Под проточным колпаком инкубируйте крышку стекла в течение 15 минут, чтобы жидкость испарилась и позволила ячейкам прилипнуть к стеклу.

Если жидкость все еще присутствует, удалите ее с помощью воздуходувки. Поместите чехлы в настольную машину для распыления и приклейте их скотчем. Закрепите чистое золото в распылительной машине.

Затем включите машину и начните распыление при низком давлении. Покройте ячейки в течение 30 секунд 80 микроамперами, что соответствует 20 нанометрам золотого покрытия. Чтобы начать визуализацию, сначала правильно проветривайте SEM в компьютерном программном обеспечении, нажав кнопку Vent.

После нанесения покрытия на ячейки перенесите их в сканирующий электронный микроскоп, или СЭМ. С помощью углеродной ленты закрепите покрытую крышку стекла на металлическом предметном столике. После того, как SEM будет проветрован, дверца должна легко открыться.

Зафиксируйте металлический столик в камере SEM, вкрутив его. Затем нажмите кнопку «Насос» в программном обеспечении. Когда система нормально считывает данные, SEM будет готов к использованию.

На вкладке Детектор нажмите на детектор SE. Включите луч, нажав на кнопку, отображающую напряжение. Начните визуализацию с более низкого напряжения, прежде чем увеличивать напряжение.

Изображение появится после включения луча. Используя функцию отслеживания, найдите область на покрытой обложке, которая скользит к изображению. Увеличьте масштаб области и найдите палочковидные структуры, которые представляют Clostridium difficile.

Чтобы откалибровать систему, увеличьте масштаб, грубо сфокусируйте изображение и свяжите Z со свободным рабочим расстоянием. Это следует делать на нескольких рабочих расстояниях, например, на 15, 9 и 5 миллиметров. Затем переключитесь в режим визуализации со сверхвысоким разрешением.

Используйте тумблеры грубой и тонкой фокусировки, чтобы начать фокусироваться при большом увеличении. Отрегулируйте переключатели астигматизма для получения более четкого изображения и проверьте четкость изображения, используя компьютерное программное обеспечение для цифрового увеличения изображения. Используйте медленное сканирование, чтобы получить высококачественное изображение.

Сохраните собранное изображение в виде файла tiff для последующего анализа, убедившись, что полоса данных выбрана, если измерения будут производиться во время анализа. Собирайте изображения под разными углами, чтобы получить больше информации о глубине, наклоняя столик на SEM. Оптимизируйте фокусировку и астигматизм перед сбором изображений с медленным сканированием.

После завершения съемки выключите луч и увеличьте рабочее расстояние до 20 миллиметров. Затем проветрьте камеру и снимите сцену. Обработайте изображения, откройте файлы изображений на Фиджи.

С помощью функции линии можно точно обвести масштабную линейку. Перейдите на вкладку «Анализ»; затем выберите функцию «Выбрать масштаб». Появится окно, которое потребует установки известного расстояния на основе масштабной линейки.

Также измените единицу длины и нажмите Okay. Наконец, чтобы измерить длину ячейки, используйте функцию line для трассировки ячейки целиком. Снова выберите вкладку Анализ, а затем нажмите кнопку Измерить.

Длина должна быть указана в единицах, обозначенных ранее. На этих изображениях показаны вегетативные клетки C.difficile, которые были захвачены во время экспоненциальной фазы кривой роста, а также споровые клетки. Вегетативные клетки представляют собой длинные, гладкие, палочковидные структуры; В то время как споры представляют собой небольшие овальные структуры, которые имеют шероховатый внешний вид.

Как показано на этом рисунке, контрольные клетки растут и достигают плато; в то время как клетки, обработанные антибиотиками ванкомицином и метронидазолом, снижают общее количество КОЕ до предела обнаружения, что указывает на бактерицидный эффект. Как показано, ванкомицин и метронидазол эффективны в уничтожении C.difficile в концентрациях супер MIC. Чтобы продемонстрировать полезность использования SEM для визуализации C.difficile, клетки были визуализированы до и после лечения препаратом, чтобы определить, как изменилась морфология.

В случае ванкомицина были поражены некоторые стенки клеток, а некоторые клетки, обработанные метронидазолом, были меньше по размеру. Чтобы проверить, влияет ли на размер клетки, длина клетки была проанализирована с помощью программы Fiji. Как показано на этом изображении, размер вегетативных клеток может несколько варьироваться в контрольном случае; Но большинство из них имеют длину примерно 6 микрометров.

Однако, как показано на этом графике, длина клеток изменялась в клетках, обработанных метронидазолом, но не в клетках, обработанных ванкомицином. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за два дня. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что образец зафиксирован и полностью высох перед нанесением покрытия и визуализацией.

Следуя этой процедуре, мы можем использовать дополнительные методы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как реакция бактерий на лечение антибиотиками; И это может дать нам больше информации о понимании механики действия антибиотиков, например. Этот метод обладает огромным потенциалом и может проложить путь исследователям в области микробиологии к дальнейшему изучению физиологии и фармакологии Clostridium difficile. Надеюсь, вам понравилось смотреть это видео сегодня.

Я надеюсь, что вы получили от этого информацию о том, как выращивать и характеризовать клетки C.difficile, как смотреть на кинетику уничтожения антибиотиков против C.difficile, а затем как оценивать морфологические изменения, связанные с этими моделями убийства, с помощью высокоуровневой микроскопии. Пока мы работаем с Clostridium difficile, мы должны принимать дополнительные меры предосторожности и использовать все защитные средства