Абсолютный Количественное A & beta; _1-42 В спинномозговой жидкости С помощью масс-спектрометрического Reference Процедура измерения

Общей целью данной методики эталонных измерений является гармонизация измерений бета в спинномозговой жидкости человека. Этот метод может помочь стандартизировать анализы для измерения ликвора бета-42, который является биомаркером центральной амилоидной патологии и невропатологическим признаком болезни Альцгеймера. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он тщательно валидирован и не использует антитела для количественного определения AVR 142.

Применение этого метода распространяется и на терапию болезни Альцгеймера, поскольку он будет использоваться для гармонизации анализов и облегчения введения общих пороговых уровней в клинических испытаниях. В то время как этот метод может дать представление о патологии амилоида у людей, он также может быть применен к другим смертным организмам, таким как трансгенные мыши и нечеловекообразные приматы, для создания новых лекарств. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что AVR 142 очень гидрофобен и может легко прилипать к таким поверхностям, как наконечники пипеток и трубки.

Сначала добавьте 40 микролитров бета-пептида N15 к 0,46 миллилитров 20% ацетонитрила и 4% концентрированного аммиака в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитров. Перемешайте пептидный раствор на вихревом миксере в течение одной минуты. Добавьте 50 микролитров раствора пептида к 1,95 миллилитров 20% ацетонитрила и 4% концентрированного аммиака в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.

Перемешайте пептидный раствор на вихревом миксере в течение одной минуты. Затем приготовьте шесть растворов калибраторов, смешав соответствующие объемы каждого раствора в микроцентрифужных пробирках. После смешивания растворов калибратора подготовьте окончательные калибраторы в двух экземплярах, смешав соответствующие объемы соответствующих растворов калибратора и ликвора человека в микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 миллилитров.

Перемешайте каждый раствор на вихревом миксере в течение одной минуты. Чтобы приготовить внутренний стандарт, сначала добавьте 32 микролитра бета-пептида 13C к 1,968 мл 20% ацетонитрила и 4% концентрированного аммиака в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Перемешайте пептидный раствор на вихревом миксере в течение одной минуты.

Далее добавьте 0,1 миллилитра пептидного раствора к 4,9 миллилитрам 20% ацетонитрила и 4% концентрированного аммиака в пятимиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Перемешайте пептидный раствор на вихревом миксере в течение одной минуты. Чтобы приготовить образец с коэффициентом отклика, добавьте 40 микролитров нативного бета-пептида к 0,46 мл 20% ацетонитрила и 4% концентрированного аммиака в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мкл.

После смешивания добавьте 20 микролитров раствора пептида и 20 микролитров четырех микрограммов на миллилитр, 15N бета-пептида к 1,96 миллилитров 20% ацетонитрила и 4% концентрированного аммиака в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Перемешайте пептидный раствор на вихревом миксере в течение одной минуты. После этого добавьте 20 микролитров раствора пептида к 0,38 миллилитрам искусственного ликвора в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитров.

После подготовки дубликатов перемешайте каждый раствор на вихревом миксере в течение одной минуты. После размораживания образцов на валике добавьте по 0,18 миллилитров каждого калибратора, коэффициента отклика и неизвестного образца в луночный планшет с содержанием белка 96 объемом в один миллилитр, обязательно добавляя образцы на дно лунок или близко к нему. Теперь добавьте 20 микролитров внутреннего стандарта в каждую лунку, выпустив каплю стандарта на боковой стороне лунки близко к поверхности образца, не погружая наконечник пипетки.

Затем добавьте в каждую лунку по 0,2 миллилитра пяти моляров гидрохлорида гуанадина. Поместите планшет с образцами на шейкер для микропланшетов и перемешивайте образцы в течение 45 минут при 1100 об/мин. После перемешивания добавьте в каждую лунку по 0,2 миллилитра 4%-ной фосфорной кислоты.

Затем поместите планшет с образцом на шейкер для микропланшетов и кратко перемешайте при 1000 об/мин. Поместите тарелку-резервуар для отходов под твердофазную экстракцию со смешанным катиновым обменом 96 лунок или пластину SPE в камеру коллектора экстракционной пластины. Далее кондиционируйте сорбент SPE, добавив по 0,2 миллилитра метанола в каждую лунку.

Затем уравновесьте сорбент, добавив в каждую лунку по 0,2 миллилитра 4%-ной фосфорной кислоты. С помощью восьмиканального пипета перенесите все пробы из глубоколуночного планшета в планшет SPE. После этого дважды промыть сорбент после прохождения проб, добавив в каждую лунку по 0,2 миллилитра 4%-ной фосфорной кислоты.

После того как моющий растворитель выйдет из сорбента, замените лоток резервуара трубками. Теперь элюируйте образец из сорбента, добавив два алокатов по 50 микролитров 75% ацетонитрила и 10% концентрированного аммиака, учитывая, что этот раствор требует очень низкого вакуума для прохождения через сорбент. Высушите элюирование с помощью вакуумного центрифугирования без применения тепла.

Наконец, запечатайте пробирки и заморозьте их при температуре 80 градусов Цельсия до анализа. Калибраторы расположены близко к линии регрессии с низкими стандартными отклонениями. Если калибровка нелинейна, прогон должен быть отброшен, и отклонение, скорее всего, связано с неправильной техникой пипетирования и/или ошибками при разведении калибраторов.

Коэффициент вариации репликатов предпочтительно должен быть ниже 10%Нативные 15N и 13C бета-элюй из колонки LC одновременно с близкими к симметричным пиками и без значительного хвостового оперения. Для каждого пика должно быть выполнено не менее 10 измерений, которые могут быть скорректированы с максимальным временем впрыска в методе. Пептиды могут быть измерены одновременно во время анализа МС, если только чувствительность метода не является неоптимальной, при котором для каждой инъекции следует измерять только представляющие интерес пептиды.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что перед переносом пептидного раствора кончики пипета всегда должны быть насыщены. Также важно использовать пробирки с как можно меньшим объемом пустот.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области болезни Альцгеймера к изучению соответствия с другими методами, такими как амилоидная ПЭТ-томография. Он также был использован для присвоения концентраций бета-142 эталонным материалам на основе СМЖ. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как готовить калибраторы в спинномозговой жидкости человека и использовать твердофазную экстракцию перед анализом LCMS для измерения абсолютной концентрации бета-142 в образцах.

Не забывайте, что работа с спинномозговой жидкостью человека может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как перчатки, защитные очки и другие меры безопасности.