Использование в пробирке клеток Imaging для изучения химиотерапевтические доставлены на липидной основе наночастиц

Общая цель данного метода визуализации живых клеток состоит в том, чтобы проследить за такими клеточными процессами, как поглощение и распределение химиотерапевтических препаратов, без необходимости в фиксации. Эти методы позволяют ответить на ключевые вопросы в области онкологии, например: каким образом опухолевые клетки поглощают химиотерапевтические препараты, находящиеся либо в свободной форме, либо инкапсулированные в наночастицы. Главное преимущество этого метода заключается в том, что мы визуализируем живые клетки, что позволяет избежать артефактов фиксации и проводить динамическую оценку в режиме реального времени.

Идея этого метода возникла у нас после того, как мы заметили, что наночастицы разрушались в процессе фиксации, что приводило к неправильной интерпретации доставки лекарственного препарата. Для сборки камеры для визуализации поместите покровное стекло диаметром 25 миллиметров в нижнюю часть камеры и прикрутите верхнюю часть к нижней. Не затягивайте слишком сильно, так как стекло может разбиться.

Автоклавируйте камеру целиком. Для посева клеток извлеките из стерилизационного пакета камеру для визуализации, находясь в ламинарном шкафу. Осторожно затяните крепление камеры и поместите ее в чашку Петри.

Покройте стекло камеры для визуализации одним миллилитром 0,1% стерильного желатина на 20 минут при 37 °C и 5% CO2. После удаления среды из флаконов с клеточной культурой один раз промойте клетки 1x PBS и отделите их с помощью 0,25% трипсина. Инактивируйте трипсин, добавив среду для культивирования клеток.

Затем соберите клетки и центрифугируйте их при 1 100 G в течение пяти минут. Ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах среды для культивирования клеток. После подсчета клеток, описанного в текстовом протоколе, аспирируйте желатин и высейте клетки в таком разведении, которое обеспечит максимальное покрытие поверхности на 70 % в течение 24 часов.

Оставьте клетки для адгезии при 5% Carbon Dioxide и 37 °C в течение 24 часов. Проведите оценку клеток под микроскопом на предмет конфлюэнтности, морфологии клеток и наличия контаминации. Затем включите конфокальный микроскоп, флуоресцентный осветитель и компьютер.

Подключите нагреватель объектива к объективу и установите температуру 35 °C. Подготовьте инкубационную камеру согласно текстовому протоколу. Поместите инкубационную камеру на предметный столик микроскопа и подключите трубки подачи и отвода Carbon Dioxide.

Откройте главный клапан подачи углекислого газа и включите контроллер углекислого газа. Убедитесь, что контроллер настроен на 5% CO2. Надлежащие условия культивирования клеток, такие как температура, CO2, pH, влажность и стерильность, имеют решающее значение для длительной визуализации клеток.

Таким образом, каждый инкубатор необходимо надлежащим образом протестировать. Установите температуру в камере на 37 °C. Дождитесь, пока в инкубационном блоке будет достигнута выбранная температура и процентное содержание Carbon Dioxide.

Извлеките камеру для визуализации из основного инкубатора с углекислым газом и перенесите её в чашке Петри в помещение для микроскопии. Поместите камеру для визуализации в специально изготовленный держатель предметного столика диаметром 35 мм и закройте камеру специальной герметичной крышкой. Откройте блок инкубации и, действуя максимально быстро, чтобы предотвратить охлаждение клеток, замените красный патч камерой для визуализации, после чего закройте блок.

Убедитесь, что между предметным столиком и микроскопом не зажаты кабели. Оставьте прибор для акклиматизации на 30 минут. Затем откройте программное обеспечение и включите лазер.

Создайте новую базу данных, нажав «New» во вкладке «File». Присвойте базе данных имя и сохраните ее. Настройте конфигурацию, нажав «Config» во вкладке «Acquire».

Выберите «Channel Mode» и «Single Track» для анализа одного флуорофора. Выберите «Multi Track» для анализа нескольких флуорофоров. Затем подберите соответствующие длинноволновые фильтры, соответствующие данному флуорофору.

Выберите канал светлого поля в одном из треков. При сканировании существует компромисс между интенсивностью флуоресцентного сигнала соединений и качеством изображения. Переэкспозиция, фотообесцвечивание, соотношение сигнал/шум, состояние клеток и вводимые соединения — все эти факторы могут повлиять на результаты и требуют надлежащей проверки.

Настройте управление сканированием, нажав «Scan» на вкладке «Acquire». Затем нажмите «Mode», чтобы установить размер кадра, скорость сканирования, направление сканирования и усреднение сканирования. Нажмите «Channels», чтобы настроить диафрагму (Pinhole), усиление (Gain) и смещение (Offset), а также мощность лазера.

Сохраните эти настройки, нажав «Config» на вкладке «Configuration», и сохраните их в базе данных конфигурации. Настройте таймлапс, нажав «Muti TimeX» на вкладке «Macro». Нажмите «Single Location».

Примените сохраненную конфигурацию, нажав «Single Track», и прокрутите список до нужной конфигурации в базе данных конфигураций. Установите временной интервал и количество сканирований. Загрузите конфигурацию, нажав «Load Conf».

Укажите название таймлапса в поле «Base File Name» и выберите базу данных, нажав «Image Data Base», чтобы сохранить таймлапс. Укажите временную папку, нажав «Temporary Image Folder». Затем откройте инкубационный блок, поднимите кольцо визуализации, нанесите каплю иммерсионного масла на объектив и как можно быстрее закройте блок. Сфокусируйтесь и выберите положение в камере визуализации.

В ламинарном шкафу разведите свободный препарат или наночастицы до концентрации 5 мкг/мл препарата или 0,05 мкмоль липидов в среде для культивирования клеток. Если препарат или наночастицы не стерильны, профильтруйте раствор через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Откройте инкубационную камеру и поднимите верхнюю крышку.

Затем удалите среду из лунок с клетками, добавьте 1 мл разведенного препарата или наночастиц и как можно быстрее закройте модуль. Сфокусируйтесь на клетках и выполните быстрое сканирование, нажав «Single» на вкладке Scan Control. Когда на изображении в светлом поле появятся сфокусированные клетки, запустите запись таймлапса, нажав «Start Time» в макросе Multi TimeX.

Количество повторений и оставшееся время отображаются в окне Macro и на изображениях. Регулярно проверяйте, остаются ли клетки в фокусе, или используйте функцию Autofocus. Программа автоматически сохраняет таймлапс в базе данных.

Не закрывайте базу данных во время работы программы. Здесь представлен трехчасовой таймлапс клеток, подвергнутых воздействию свободного доксорубицина. Обратите внимание на поглощение и немедленный перенос красного флуоресцентного доксорубицина в ядро.

Здесь клетки инкубировали в течение трех часов с инкапсулированным доксорубицином. Флуоресцентный сигнал значительно слабее и локализован в цитоплазме. В ядре сигнал практически не виден.

При переносе этих таймлапс-видео в Image J можно выделить область интереса вокруг ядра и измерить плотность пикселей. Представленный здесь график показывает различие в поглощении вещества ядрами с течением времени в клетках, инкубированных либо со свободным, либо с инкапсулированным доксорубицином. Здесь показаны клетки, инкубированные с инкапсулированным доксорубицином, отмеченные красным цветом.

Фиолетовый сигнал соответствует носителю, а лизосомы окрашены зеленым маркером живых клеток. Сравнение двух типов клеток выявляет разницу в распределении лизосом. В клетках B16BL6 лизосомы распределены по всей цитоплазме.

В то время как в клетках BLM лизосомы расположены близко к ядру, в обеих клеточных линиях наблюдается высокая колокализация красного и пурпурного сигналов в лизосомах, что указывает на удержание доксорубицина и его носителя в этих органеллах. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить визуализацию поглощения химиотерапевтических средств и других флуоресцентных маркеров в живых клетках на протяжении нескольких часов или даже дней.