Анализ Дендритные Морфология в столбцах и слоях
23 марта 2017 г.
Здесь мы покажем , как анализировать дендритных маршрутизацию продолговатого мозга нейронов дрозофилы в столбцах и слоях. Технологический процесс включает в себя метод визуализации двойного просмотра для улучшения качества изображения и вычислительных средств для отслеживания, регистрации дендритные беседок в массив опорного столбца и для анализа дендритных структур в 3D-пространстве.
Общая цель этого протокола заключается в анализе дендрической маршрутизации нейронов мозгового вещества взрослой дрозофилы в колонках и слоях для характеристики дендрических паттернов, определения типов клеток на основе морфологии и идентификации мутантов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, включая картирование схем мозга и понимание механизма подключения дендрита. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он передает дендритные свойства в трехмерном пространстве, тем самым улучшая понимание дендритной логики и функций.
Целью этой процедуры является получение двух стеков изображений интересующих нейронов в двух ортогональных, горизонтальных и фронтальных ориентациях. Используя стандартные методики, окрашивают рассеченный мозг мухи с помощью анти-GFP кролика и антитела, которое маркирует аксоны фоторецепторов как первичные антитела. Затем пометьте первичные антитела флуоресцентными вторичными антителами и очистите мозг 70% глицерином и 1X PBS.
Чтобы установить мозг в горизонтальной ориентации, перенесите очищенный глицерином мозг в каплю объемом 20 микролитров монтажной среды, противовыцветающей, нанесенной по центру предметного стекла микроскопа. Затем на покровную крышку прикрепите небольшие участки глины по четырем углам, чтобы она не раздавила мозг. Теперь под микроскопом для препарирования расположите мозг в вентральном положении вверх.
Используйте выпуклую дорсальную поверхность мозга в качестве ориентира для определения ориентации образца мозга. Это обеспечит горизонтальное изображение нейрона. Затем прикрепите покровную крышку.
С помощью конфокального микроскопа, в идеале оснащенного детекторами GaAsP, можно получить стек изображений горизонтального обзора с объективом с высокой числовой апертурой и цифровым зумом 2,5. Получите не менее 180 оптических сечений, 512 квадратных пикселей и размер шага 2 микрона. После съемки первой стопки изображений снимите покровное стекло со предметного стекла и переместите мозг в переднее положение вверх, чтобы обеспечить фронтальный обзор.
Затем, используя ту же технику, создайте новую стопку изображений фронтального вида тех же нейронов, которые изображены в горизонтальном виде. Обязательно также запишите расположение интересующего нейрона по отношению к нейропалу мозгового вещества. Идентификация одних и тех же нейронов возможна при меньшем увеличении.
Однако, если сигнал теряется из-за того, что ткань находится глубоко, просто сфотографируйте вентральную половину вашего мозга. Также проверьте, двигался ли образец во время получения изображений, изучив стеки изображений. Десвертка изображения и объединение изображений подробно описаны в текстовом протоколе.
Целью данной процедуры является отслеживание нейритов и присвоение опорных точек для регистрации. Сначала откройте файл объединенного изображения. Затем перейдите к редактированию.
Затем отобразите настройку дисплея и выключите фоторецепторный канал, который горит красным цветом. Далее визуализируйте изображение в режиме surpass. Если компьютер оснащен стереографической системой, включите стереосистему и используйте режим четырехугольного буфера для визуализации 3D-изображений.
Добавляем новые нити, переходим к превзойдению, затем нити, и нажимаем на вкладку с надписью пропустить автоматическое создание, редактируем вручную. Затем нажмите на вкладку рисования и выберите AutoDepth. Далее выбираем настройки.
Переключите опцию линии и введите соответствующее количество пикселей для лучшей визуализации. Затем переключите отображение дендритов, начальной точки и точки ветвления и установите качество рендеринга на 100%Теперь выберите вкладку рисования и начните трассировку нейритов. Начните с аксона, затем двигайтесь к дендритам.
Аксон и дендриты трансмозговых нейронов должны быть легко дифференцированы. После отслеживания нейритов вернитесь в настройки и переключите как начальную точку, так и точку ветвления. Потом идти на превзойти, потом экспортировать.
Выберите объект и сохраните нить накала в качестве файла inventor. Следующим шагом является назначение опорных точек. Для начала выберите «Показать настройку дисплея» и включите оба канала изображения.
Затем перейти к превзойдению, затем к измерению. И на вкладке редактирования переключите определенный канал и выберите в данном случае канал фоторецептора. Теперь назначьте опорные точки для верхнего слоя.
Выберите выход, затем точки измерения и отметьте начало слоя m1 как верхний слой. Используйте функцию плоскости отсечения для упрощения назначения точек. Порядок точек следующий: экваториальный, передний экваториальный, передний, передний вентральный, вентральный, задний вентральный, задний, задний экваториальный и центральный.
Если найти центральный фоторецептор, то именно он связан с наибольшим количеством дендритных процессов. Далее, назначьте опорные точки для слоев R8 и R7, используя ту же технику. После определения каждого набора опорных точек экспортируйте координаты.
Выберите статистику, затем детализированную, конкретные значения и позицию. Затем выберите экспорт статистики на вкладке отображения в файл и сохраните координаты в виде файла CSV. Затем откройте три файла CSV в редакторе электронных таблиц.
Скопируйте и вставьте координаты 27 опорных точек в новый файл, следуя порядку top, R8, а затем R7. Следуйте текстовому протоколу стандартизации жесткого тела и нелинейной регистрации TPS до правой вентральной конфигурации при расчете дендритных ветвящихся и терминирующих частот. В конечном счете, данные используются для построения различных информативных графиков. С помощью представленной здесь процедуры визуализации с двойным обзором мозг мухи, содержащий редко помеченные нейроны tm 20, был визуализирован в двух ортогональных направлениях.
Рекомбинация изображений повышает осевое разрешение. Рекомбинированное изображение имеет лучшее разрешение, чем изображения горизонтального и фронтального обзора. После консультации с 3D-моделями были собраны дендритные следы с 15 тм 20 нейронов и сравнены с дендритными следами с 15 тм 2 нейронов.
Были проанализированы вероятности ветвления и завершения этих нейронов. Оба типа были схожи для сегментов менее 4 мкм. Послойно-специфичный анализ дендритного окончания показал, что два типа нейронов распределяются различными слоями-специфичными способами.
Дендриты Tm 2 получают входы в м2 и в м5. В то время как tm 20 дендриты заканчиваются в слое от m1 до m3. Планарный анализ показывает, что дендриты tm 2 проецируются вперед, в то время как дендриты tm 20 проецируются назад.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить два конфокальных изображения. Прочтите свои учебные метки в файлах изображений и извлеките дендритные свойства из этих изображений. При попытке выполнить эту процедуру важно правильно пометить образец перед конфокальной визуализацией.
Так как комбинация изображений не будет выполнена, если образец будет двигаться во время визуализации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод анализа дендритной маршрутизации нейронов медуллы взрослых особей Drosophila в колонках и слоях. Метод предполагает использование методов визуализации с двойным видом и вычислительных инструментов для повышения качества изображений и анализа дендритных структур в 3D-пространстве.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Нейроанатомия
- Методы визуализации
Теоретические сведения
- Дендритная маршрутизация имеет решающее значение для понимания нейронных цепей мозга.
- Характеристика дендритных паттернов помогает в определении типов клеток.
- Идентификация мутантов может дать представление о функционировании нейронов.
- 3D-анализ улучшает понимание логики построения дендритных связей.
Цель исследования
- Для анализа маршрутизации дендритов в нейронах медуллы Drosophila.
- Для характеристики паттернов дендритов и определения типов клеток.
- Для идентификации мутантов, влияющих на морфологию дендритов.
Используемые методы
- Получите два стека изображений нейронов в ортогональных ориентациях.
- Окрасьте препарированные мозги мух специфическими антителами.
- Маркируйте первичные антитела флуоресцентными вторичными антителами.
- Проведите просветление мозга с использованием глицерина и PBS для последующей визуализации.
Основные результаты
- Усовершенствованные методы визуализации улучшают анализ структуры дендритов.
- 3D-картирование раскрывает сложное строение связей дендритов.
- Осуществляется характеристика типов клеток на основе морфологии.
- Идентификация мутантов позволяет получить представление о развитии нервной системы.
Выводы
- Данный метод значительно расширяет понимание принципов формирования дендритных путей.
- Он облегчает картирование нейронных цепей мозга Drosophila.
- В будущих исследованиях этот метод можно будет использовать для более широкого спектра приложений.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол позволяет проводить 3D-анализ архитектуры дендритов в определенных нейронных цепях с высоким разрешением, что способствует валидации мишеней в нейрофармакологии путем установления связи между структурными фенотипами и генетическими пертурбациями. Путем количественной оценки терминаций в конкретных слоях и планарной проекции дендритных деревьев метод обеспечивает механизм снижения рисков при разработке препаратов для ЦНС за счет повышения прогностической достоверности моделей нейронных цепей. Данный рабочий процесс облегчает выявление дефектов, специфичных для определенных типов клеток, помогая в согласовании трансляционных биомаркеров и уточнении доклинических моделей для нейропсихиатрических показаний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем корреляции морфологии дендритов с генетическими или фармакологическими манипуляциями в определенных подтипах нейронов.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет количественной оценки частоты ветвления и терминации дендритов в качестве функциональных показателей.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени путем установления взаимосвязи между структурой и функцией в цепях нейронов продолговатого мозга, имеющих отношение к консервативным путям нейроразвития.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает создание стандартизированных, воспроизводимых 3D-трассировок дендритов, привязанных к эталонному столбчатому каркасу для последовательной оценки морфологии.
- Количественные данные: предоставляет данные о частоте терминаций в конкретных слоях и метрики планарной проекции, что позволяет проводить высококонтентный анализ паттернов дендритов.
- Полезность платформы: использует инструментарии MIPAV и MATLAB с открытым исходным кодом, что обеспечивает масштабируемость и воспроизводимость результатов между различными лабораториями в рамках скрининговых кампаний, ориентированных на нейроанатомию.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Позволяет соотнести дефекты дендритов с конкретными слоями (например, m1–m3 для tm20 в сравнении с m2/m5 для tm2), что обеспечивает согласованность с трансляционными биомаркерами дисфункции нейронных цепей.
- Преклиническая преемственность: Предоставляет релевантную модели заболевания систему для оценки генетических мутантов, влияющих на формирование нейронных связей, что поддерживает принятие взвешенных решений о переходе к следующим этапам исследований.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет прояснить дефекты логики формирования связей в моделях нейроразвития, уменьшая неопределенность в исследованиях по взаимодействию с мишенями.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств, преобразуя данные визуализации в количественные характеристики дендритов, которые используются на этапах идентификации соединений-лидеров и доклинической валидации.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез с помощью 3D-трассировки дендритов и послойного анализа для уточнения идентичности нейронов и логики нейронных цепей.
- Скрининг: позволяет стандартизировать анализ за счет регистрации по эталону и автоматизированной трассировки дендритных деревьев при различных генетических фонах.
- Аналитика: позволяет определять частоту ветвления и терминации в качестве количественных показателей для сравнения условий в анализах мутантных форм и дикого типа.
- Трансляционные исследования: связывает предпочтения дендритов к определенным слоям с предполагаемыми гомологами в коре позвоночных, поддерживая трансляционную преемственность между видами.
- Корпоративное использование: создает многократно используемый конвейер визуализации и анализа для систематического фенотипирования нейронных мутантов в программах по поиску новых мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при фенотипировании нейронов, предоставляя данные о дендритной архитектуре с пространственным разрешением.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет рекомбинации изображений в двух проекциях и стандартизированного назначения контрольных точек между слоями.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет объективной стратификации подтипов нейронов на основе морфологии.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритезацию мишеней с поправкой на риск на основе структурной точности дендритных моделей в системах, релевантных заболеванию.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с конфокальной микроскопией, 3D-регистрацией изображений и анализом морфологии нейронов.
- Необходимы объективы с высокой числовой апертурой (high-NA), детекторы GaAsP и вычислительные платформы с поддержкой MIPAV и трассировки на базе MATLAB.
- Требуется межкомандная стандартизация для обеспечения единообразия протоколов окрашивания, просветления и визуализации в разных лабораториях.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать изменения опорных структур и определений слоев.
- Практические ограничения включают потерю сигнала в глубоких тканях и чувствительность к смещению образца при сборе данных в режиме двойного обзора.
