Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования
30 марта 2017 г.
Данная статья представляет собой протокол, оптимизированный для производства чипов микрофлюидальных и настроек микрофлюидальных экспериментов для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов одиночных дрожжевых клеток.
Общая цель данного эксперимента заключается в создании специализированного микрофлюидного устройства и его использовании для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов одной дрожжевой клетки. Этот метод может помочь ответить на некоторые из ключевых вопросов в области старения дрожжей, таких как: почему материнские клетки стареют и погибают, и какие ранние молекулярные события приводят к потере клеточного гомеостаза и, в конечном итоге, к старению и гибели клетки? Основным преимуществом данной методики является возможность одновременного отслеживания материнских клеток, их продолжительности жизни и различных молекулярных маркеров, что позволяет выявлять молекулярные события, коррелирующие с продолжительностью жизни.
Хотя данный метод позволяет получить представление о старении дрожжей, он также может быть применен в других областях, например, для мониторинга вторичных ответов на воздействие, требующих контроля состояния клеток на протяжении многих поколений. Как правило, лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как изготовление микрофлюидного устройства, загрузка клеток и настройка микроскопа требуют значительной практики для успешного выполнения. Предварительная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку правильная загрузка дрожжей в микрофлюидное устройство представляет собой сложную задачу.
Для начала изготовьте форму из кремниевой пластины для устройства, используя стандартные методы, описанные в прилагаемом текстовом протоколе. Поместите её в чашку Петри диаметром 15 сантиметров рабочей стороной вверх. Закрепите форму на чашке Петри с помощью клейкой ленты.
Затем поместите чистую лодочку для взвешивания на весы и обнулите их. Налейте 50 grams основы PDMS в лодочку, затем добавьте пять grams отвердителя PDMS. Перемешайте основу и отвердитель PDMS с помощью одноразовой пипетки.
Начните с края навесочного стаканчика и медленно двигайтесь к центру. Тщательно перемешивайте смесь в течение нескольких минут, пока по всему объему не образуются мелкие пузырьки. Медленно вылейте смесь в чашку Петри так, чтобы она полностью покрыла форму из кремниевой пластины.
Затем поместите чашку Петри в вакуум на 10 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха из смеси PDMS. Если после извлечения из вакуума на поверхности смеси остаются пузырьки, удалите их с помощью пипетки. Затем подвергните устройство термической обработке при 75 °C в течение двух часов.
После охлаждения до комнатной температуры осторожно прорежьте PDMS вокруг формы, а затем аккуратно отделите слой полимеризованного PDMS от кремниевой подложки, стараясь не повредить структуру формы. Положите слой PDMS на рабочий стол стороной с рисунком вверх. Осторожно вырежьте отдельный чип с помощью однолезвийного промышленного лезвия, оставляя достаточный отступ от края каждого отдельного чипа, чтобы избежать повреждения конструкции.
Расположив шаблон стороной с рисунком вверх, с помощью пробойника проколите отверстия строго перпендикулярно через круги входа и выхода с каждой стороны каналов. Проверьте каждое отверстие, снова вставив в него иглу пробойника. Убедитесь, что игла выходит с другой стороны, что свидетельствует об отсутствии засоров.
Затем с помощью липкой ленты удалите частицы пыли и загрязнения с верхней поверхности. Повторите этот шаг не менее трех раз, после чего оставьте чистый кусочек ленты Scotch на PDMS, чтобы поверхность оставалась без пыли. Затем переверните устройство и повторите эту процедуру на противоположной стороне PDMS.
Оставьте последний кусочек ленты и с этой стороны. Теперь подготовьте стеклянную поверхность для основания устройства. Выберите фрагмент покровного стекла размером 24 мм на 30 мм и толщиной от 13 до 17 мм.
Распылите 70% ethanol на стекло и протрите его салфеткой для удаления пыли, чтобы стерилизовать поверхность. Затем перенесите покровное стекло и PDMS на пластиковую пластину. Удалите клейкую ленту Scotch с PDMS и поместите его в пластину стороной с рисунком вверх, чтобы она не касалась верхней поверхности.
Затем поместите планшет в камеру для плазменной обработки. Подвергните PDMS и покровное стекло воздействию кислородной плазмы, чтобы сделать поверхности гидрофильными. После этого извлеките планшет из камеры и осторожно соедините поверхности PDMS и покровного стекла, обработанные плазмой.
Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха между PDMS и покровным стеклом. В завершение перенесите устройство в печь и подвергните термической обработке при 75 °C в течение не менее двух часов. За один день до подготовки чипа из PDMS погрузите входные и выходные трубки в 70% раствор этанола.
На следующий день наполните пятимиллилитровый шприц автоклавированной водой и промойте каждую пробирку, совместив ее со шприцем и пропустив через пробирку струю воды. Повторите этап промывки не менее трех раз, чтобы удалить остатки этанола. Затем исследуйте каналы PDMS под оптическим микроскопом.
Используя объектив с увеличением 10 X, убедитесь, что структуры однородны и не повреждены. Закрепите исправный чип из PDMS на платформе микроскопа с помощью клейкой ленты Scotch. Присоедините к шприцевому насосу шприц объемом 5 мл, заполненный стерильной водой, и подсоедините соответствующие входную и выходную трубки к устройству.
Установите скорость потока на 750 microliters per hour и промывайте чип в течение примерно 10 минут. Следите за каналами, чтобы убедиться, что все пузырьки воздуха вымыты. Если после 10-минутной промывки пузырьки остались, отрегулируйте скорость вручную, чтобы их удалить.
Перенесите один миллилитр подготовленного образца дрожжей в две микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте образцы в течение пяти минут при 3 000 ×g. Удалите большую часть супернатанта из каждой пробирки и объедините остатки, чтобы получить образец объемом 5 миллилитров. После того как образец дрожжей будет готов, извлеките входные трубки из чипа PDMS. Вручную переключите шприцевой насос на обратный ход, чтобы втянуть в каждую входную трубку небольшой пузырек воздуха длиной от одного до двух сантиметров, а затем втяните клеточные культуры.
Затем вставьте входную трубку обратно в чип из ПДМС и снова включите насос, чтобы загрузить клетки со скоростью 750 µL/h. Оставьте шприцевой насос включенным на 10 минут, после чего оцените процесс загрузки клеток под микроскопом. При успешной загрузке клетки будут захвачены более чем в 60% подвесных столбиков.
Для поддержания жизнеспособности дрожжевых клеток замените раствор в шприце на питательный раствор и установите скорость потока 400 µL в час. Фенотип продолжительности жизни дрожжей можно определить путем подсчета количества почек, образованных каждой захваченной материнской клеткой, и расчета оценки Каплана-Мейера. При использовании данного протокола устройство часто захватывает новые дочерние клетки, отпочковавшиеся от уже захваченных клеток.
Затем эти клетки превращаются в новые материнские клетки, которые можно идентифицировать с помощью программного обеспечения для последующего анализа изображений. Эти новые материнские клетки обеспечивают более точное измерение продолжительности жизни. В данном эксперименте средняя продолжительность жизни новых материнских клеток была немного больше — примерно на два поколения.
Помимо количества почек, на основе данных визуализации можно определить временной интервал между двумя последовательными событиями почкования. К концу срока жизни скорость почкования резко снижается, что указывает на неблагоприятное состояние этих стареющих клеток. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использовать свежеизготовленный чип для предотвращения появления пузырьков, а также при необходимости увеличить концентрацию клеток для повышения эффективности их загрузки.
После своей разработки эта методика открыла исследователям в области старения дрожжей возможность изучать ранние молекулярные изменения, которые являются причиной фенотипа старения. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготовить это микрофлюидное устройство и как использовать его для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов в отдельных клетках.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол создания специализированных микрофлюидных устройств для измерения продолжительности жизни и анализа клеточных фенотипов отдельных клеток дрожжей. Этот метод направлен на решение ключевых вопросов в области старения дрожжей, в частности, касающихся процессов старения материнских клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микрофлюидика
- Клеточная биология
- Старение дрожжей
Теоретические основы
- Микрофлюидные устройства позволяют осуществлять точный контроль клеточной среды.
- Изучение старения дрожжей может дать представление о более широких биологических процессах старения.
- Отслеживание материнских клеток и их молекулярных маркеров имеет решающее значение для данного исследования.
- Правильная загрузка дрожжей в микрофлюидные устройства является сложной задачей и требует определенного навыка.
Цель исследования
- Измерение продолжительности жизни отдельных клеток дрожжей.
- Исследование молекулярных событий, приводящих к клеточному старению.
- Установление корреляции между продолжительностью жизни и различными молекулярными маркерами.
Используемые методы
- Изготовление микрофлюидных устройств.
- Загрузка клеток дрожжей в устройства.
- Настройка микроскопа для наблюдения.
- Отслеживание клеточных фенотипов и продолжительности жизни.
Основные результаты
- Успешное отслеживание материнских клеток и определение продолжительности их жизни.
- Идентификация молекулярных маркеров, связанных со старением.
- Понимание процессов старения клеток дрожжей.
- Потенциальное применение в других областях клеточных исследований.
Выводы
- Микрофлюидный метод дает ценную информацию о старении дрожжей.
- Трудности при изготовлении устройства и загрузке клеток можно преодолеть с помощью практики.
- Данный метод может быть применим в других областях исследований, требующих длительного наблюдения за клетками.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный микрофлюидный подход позволяет осуществлять высокоразрешающий лонгитюдный мониторинг динамики старения отдельных клеток, что дает возможность понять механизмы нарушения клеточного гомеостаза, которые могут быть использованы для валидации мишеней в путях старения. Путем корреляции молекулярных маркеров с показателями продолжительности жизни в контролируемой микросреде данный метод обеспечивает прогностическую достоверность при тестировании гипотез на ранних стадиях в отношении консервативных механизмов долголетия. Возможность масштабирования метода для различных штаммов и условий делает его универсальной платформой для поиска и снижения рисков при выборе терапевтических мишеней для заболеваний, связанных со старением.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая молекулярные события с функциональными фенотипами старения в отдельных клетках.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет корреляции биомаркеров с траекториями продолжительности жизни в режиме реального времени.
- Научная ценность: повышает уверенность в выборе мишеней путем идентификации консервативных молекулярных факторов старения при различных генетических фонах.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка стандартизированных, воспроизводимых биологических систем для количественного фенотипического скрининга в нескольких каналах.
- Практическая ценность: Обеспечение визуализации высокого разрешения и показателей частоты почкования, что позволяет достоверно оценивать эффект соединений.
- Научная ценность: Облегчение масштабирования анализа за счет захвата сотен клеток в каждом канале для проведения лонгитюдного анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает понимание систем, имеющих значение для патологии, путем характеристики динамики клеточного старения с одноклеточным разрешением.
- Практическая ценность: обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до стандартизированного измерения продолжительности жизни и фенотипа.
- Научная ценность: способствует снижению механистических рисков за счет разграничения причинных молекулярных событий и корреляционных изменений при старении.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, позволяя проводить исследования старения на основе гипотез, что способствует идентификации перспективных соединений за счет фенотипической привязки молекулярных мишеней.
- Открытия в биологии: способствует уточнению путей передачи сигналов за счет отслеживания молекулярных маркеров в режиме реального времени параллельно с репликативным временем жизни материнских клеток.
- Скрининг: обеспечивает количественные, разделенные во времени фенотипические показатели, такие как интервалы почкования и изменения морфологии, для скрининга соединений.
- Аналитика: позволяет генерировать оценки выживаемости по методу Каплана-Мейера и данные о родословных на уровне отдельных клеток для проведения сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, предоставляя консервативные фенотипы старения, которые могут быть перенесены на более сложные эукариотические модели.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как модульная платформа, адаптируемая к различным штаммам дрожжей и условиям окружающей среды для многократного использования.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет уменьшения неопределенности при связывании молекулярных маркеров с результатами старения.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам изготовления устройств и загрузки клеток.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований («go/no-go»), обеспечивая раннее обнаружение неэффективных вмешательств в пути старения.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем идентификации мишеней с сильной фенотипической валидацией в моделях старения.
Особенности реализации
- Требуется опыт в изготовлении микрофлюидных устройств и стерильной работе с биомолекулами.
- Зависит от наличия систем плазменной обработки, шприцевых насосов и установок для флуоресцентной микроскопии.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия подготовки чипов и работы со штаммами дрожжей.
- При распространении метода на модельные системы, отличные от дрожжей, требуются корректировки в связи с различиями в размере и адгезии клеток.
- Ограничено необходимостью тщательного удаления пузырьков воздуха и очистки поверхностей для обеспечения надежного захвата клеток и получения качественных изображений.
