Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования

Общая цель этого эксперимента — создать специализированное микрофлюидное устройство и использовать его для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов одной дрожжевой клетки. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в области старения дрожжей, например, почему материнские клетки стареют и умирают и каковы более ранние молекулярные события, которые приводят к потере клеточного гомеостаза и, в конечном итоге, к старению и гибели клеток? Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем отслеживать материнские клетки, отслеживать их продолжительность жизни и различные молекулярные маркеры одновременно, поэтому мы можем искать молекулярные события, которые коррелируют с продолжительностью жизни.

Хотя этот метод может дать представление о старении дрожжей, он также может быть применен в других областях, таких как мониторинг вторичных реакций на участие, что требует проверки клеток в течение многих поколений. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что изготовление микрофлюидных устройств, загрузка клеток, настройка микроскопа требуют большой практики для успешной работы. Предварительная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как трудно правильно загрузить микрофлюидное устройство дрожжами.

Для начала изготовьте форму из силиконовой пластины для устройства с использованием стандартных методов, описанных в сопроводительном текстовом протоколе. Поместите его лицевой стороной вверх в 15-сантиметровую чашку Петри. Закрепите форму на чашке Петри лентами.

Далее поставьте чистую весовую лодочку на весы и порвите весы. Налейте 50 граммов основы PDMS в лодку для взвешивания, а затем добавьте пять граммов отвердителя PDMS. Размешайте основание PDMS и отвердитель с помощью одноразовой пипетки.

Начните с края весовой лодки и медленно двигайтесь внутрь. Тщательно перемешивайте смесь в течение нескольких минут, пока по всей смеси не образуются мелкие пузырьки. Медленно вылейте смесь в чашку Петри, чтобы она полностью покрыла силиконовую вафельную форму.

Затем поместите чашку Петри в вакуум на 10 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха из смеси PDMS. Если после извлечения из вакуума на поверхности смеси остаются пузырьки, используйте пипетку, чтобы выдуть их. Далее запекаем прибор при температуре 75 градусов Цельсия в течение двух часов.

После охлаждения до комнатной температуры осторожно разрежьте PDMS вокруг формы, а затем аккуратно снимите слой полимеризованного PDMS с силиконовой формы для пластин, избегая повреждения конструкции формы для пластин. Поместите слой PDMS на скамейку стороной шаблона вверх. Аккуратно вырежьте отдельную стружку с помощью лезвия промышленной бритвы с одной кромкой, сохраняя достаточный запас от края каждой отдельной стружки, чтобы избежать повреждения конструкции.

Стороной шаблона вверх с помощью перфоратора проделайте отверстия прямо вниз через входные и выходные круги с каждой стороны каналов. Проверьте каждое отверстие, снова вставив иглу перфоратора в отверстие. Убедитесь, что игла может выйти с другой стороны, что указывает на отсутствие засоров.

Затем используйте ленту для очистки верхней поверхности от частиц пыли и мусора. Повторите этот шаг не менее трех раз и оставьте чистый кусок скотча на PDMS, чтобы сохранить поверхность без пыли. Затем переверните прибор и повторите эту процедуру на противоположном участке ПДМС.

Последний кусок скотча оставьте и на этой стороне. Теперь подготовьте стеклянную поверхность для основания устройства. Выберите кусок покровного стекла размером 24 на 30 миллиметров толщиной от 13 до 17 миллиметров.

Распылите на стекло 70% этанола и высушите его пылеудалителем, чтобы стерилизовать поверхность. Затем переложите покровное стекло и PDMS на пластиковую пластину. Снимите скотч с PDMS и поместите выкройку стороной вверх в пластину, не касаясь верхней поверхности.

Затем перенесите пластину в плазменную камеру. Примените кислородную плазменную обработку к PDMS и защитному стеклу, чтобы придать поверхности гидрофильность. Затем извлеките пластину из плазменной камеры и аккуратно соедините обработанные плазмой поверхности PDMS в покровное стекло.

Убедитесь, что между PDMS и покровным стеклом нет пузырьков воздуха. Наконец, перенесите устройство в духовку и выпекайте при температуре 75 градусов Цельсия не менее двух часов. Погрузите входную и выходную трубки в раствор 70% этанола за сутки до подготовки микросхемы PDMS.

На следующий день наполните пятимиллилитровый шприц автоклавной водой, и промойте каждую трубку, поместив трубку на шприц и промыв трубку водой. Повторите этап промывки не менее трех раз, чтобы удалить остатки этанола. Далее рассмотрите каналы PDMS под оптическим микроскопом.

Используя объектив с 10-кратным увеличением, убедитесь, что структуры однородны и неповреждены. Стабилизируйте неповрежденный чип PDMS на платформе микроскопа с помощью скотча. Закрепите пятимиллилитровый шприц, загруженный стерильной водой, в шприцевом насосе и вставьте соответствующие входные и выходные трубки в устройство.

Установите скорость потока 750 микролитров в час и промойте чипсу около 10 минут. Следите за каналами, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха смыты. Если после 10-минутного полоскания остались пузырьки, вручную отрегулируйте скорость, чтобы удалить пузырьки.

Перелейте один миллилитр подготовленного образца дрожжей в две микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте образцы в течение пяти минут при температуре 3000 G. Удалите большую часть надосадочной жидкости из каждой пробирки и соедините оставшуюся часть для получения образца объемом 5 миллилитров. Теперь, когда образец дрожжей готов, извлеките входные пробирки из микросхемы PDMS. Вручную переверните шприцевой насос, чтобы всосать небольшой пузырь воздуха длиной от одного до двух сантиметров в каждую входную трубку, а затем всасывать клеточные культуры.

Затем вставьте входную трубку обратно в микросхему PDMS и перезапустите насос для загрузки ячеек со скоростью 750 микролитров в час. Оставьте шприцевую помпу включенной на 10 минут, а затем рассмотрите прогрессию загрузки клеток под микроскопом. Успешная загрузка приведет к тому, что ячейки будут захвачены под более чем 60% подвесного столба.

Чтобы сохранить дрожжевые клетки, переключите раствор в шприце на питательный, и отрегулируйте скорость до 400 микролитров в час. Фенотип продолжительности жизни дрожжей может быть получен путем подсчета количества почек, производимых каждой захваченной материнской клеткой, и оценки по шкале Каплана-Мейера. Используя этот протокол, устройство часто захватывает свежие дочерние клетки, которые отпочковались от уже захваченных клеток.

Затем эти клетки превращаются в свежие материнские клетки, которые могут быть идентифицированы с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Эти свежие материнские клетки обеспечивают более точное измерение продолжительности жизни. В этом эксперименте средняя продолжительность жизни свежих материнских клеток была немного больше, примерно на два поколения.

В дополнение к количеству бутонов из данных визуализации можно извлечь временной интервал между двумя последовательными событиями почкования. Почкование резко замедляется к концу их жизни, что указывает на нездоровое состояние этих старых клеток. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно использовать как свежеизготовленный чип, чтобы избежать образования пузырей, так и увеличить концентрацию клеток, чтобы повысить эффективность загрузки клеток, когда это необходимо.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области старения дрожжей к изучению ранних молекулярных изменений, которые являются причиной фенотипа старения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сделать это микрофлюидное устройство и как использовать его для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов в отдельных клетках.