Использование анализа на основе β-лактамаз Conductimetric биосенсора для обнаружения биомолекулярного взаимодействия

Общей целью данного кондуктивного биосенсорного анализа является обнаружение биомолекулярных взаимодействий с использованием гибридной технологии бета-лактамаз. Мы описываем метод обнаружения антигенных взаимодействий антител с использованием химерного белка бета-лактамазы. Принцип этого метода основан на обнаружении связывания путем измерения высвобождения протонов бета-лактамазной активности.

Основным преимуществом данной методики перед обычными иммуносенсорами является использование химерной бета-лактамазы, что позволяет проводить более дешевые и быстрые сенсорные анализы за счет использования гибридного белка для обнаружения аналитов. Начните эту процедуру с приготовления образца белка и раствора, как описано в текстовом протоколе. Приготовьте многоразовый электрод, опустив наконечники в лунки 96-луночной пластины, содержащей 300 микролитров на лунку раствора для приготовления электрода, в течение двух минут при осторожном перемешивании при комнатной температуре.

Повторите этот шаг три раза. Затем промойте электроды, опустив наконечники в лунки 96-луночной пластины, содержащей 300 микролитров на лунку дистиллированной воды, в течение двух минут с аккуратным перемешиванием при комнатной температуре. Чтобы регенерировать электроды, опустите наконечники в лунки 96-луночного планшета, содержащего 300 микролитров на лунку регенерационного раствора, на ночь при четырех градусах Цельсия или на один час при комнатной температуре.

Затем выполните три промывки электродов, погрузив наконечники в лунки 96-луночного планшета, содержащего 300 микролитров на лунку фосфатно-солевого буфера. Выполняйте каждую стирку в течение двух минут, аккуратно перемешивая при комнатной температуре. Нанесите лизоцим куриного яйца на полианилиновую поверхность электрода, нанеся на поверхность электрода каплю в 15 микролитров 40 микрограммов на миллилитр HEWL, приготовленного в фосфатном буфере.

Инкубируйте электрод в течение часа при комнатной температуре. Далее выполните три промывки электродов фосфатным буфером, погрузив электродные части чипов датчика в лунку 96-луночного планшета, содержащего 300 микролитров фосфатного буфера на лунку. Выполняйте каждую стирку в течение двух минут, аккуратно перемешивая при комнатной температуре.

Пропитайте электроды, добавив каплю блокирующего раствора объемом 30 микролитров на поверхность электрода. Выдерживать в течение одного часа при комнатной температуре. Затем постирайте три раза, как и раньше.

Растворы BlaP-cAb-Lys3 или BlaP развести до 20 мкг на миллилитр в связывающем буфере. Затем нанесите на электроды каплю этого разбавленного раствора объемом 15 микролитров. Инкубируйте электроды в течение одного часа при комнатной температуре.

После реакции нанотела антигена трижды промойте электроды промывочным раствором. Затем промойте электроды датчика в буфере обнаружения, погрузив электроды в лунку 96-луночного планшета, содержащую 300 микролитров на лунку буфера обнаружения. И высиживайте непродолжительно в течение одной минуты.

Для обнаружения подключите цифровой мультиметр к компьютеру. Затем подключите микросхему датчика к цифровому мультиметру через медную цепную часть. Инициируйте реакцию датчика, нанеся каплю 50 микролитров четырехмиллимолярного раствора бензилпенициллина на электроды с положительной меткой.

Нанесите каплю раствора детектирования объемом 50 микролитров на электроды с отрицательной меткой, чтобы они служили отрицательным контролем. Контролируйте кондуктометрические показатели с помощью подключенного цифрового мультиметра в течение 30 минут. Визуализируйте данные в режиме реального времени прямо на экране или экспортируйте цифровые данные в виде текстового файла.

Эти исходные данные могут быть построены на графике для создания графического вывода, представляющего измерения изменений проводимости между электродами сравнения и образца во времени. Для создания химерного белка в качестве белка-носителя использовали бета-лактамазу BlaP класса А. Здесь каталитические остатки представлены красным цветом.

Место введения, расположенное в контуре, подверженном воздействию растворителя, обозначено желтым цветом. Фрагмент верблюжьего антитела под названием cAb-Lys3 был вставлен в BlaP. Полученный в результате химерный белок, BlaP-cAb-Lyse3, способен связываться с HEWL, сохраняя при этом активность бета-лактамаз.

HEWL был иммобилизован на полианилиновый кодированный электрод перед загрузкой BlaP-cAb-Lys3. Высвобождение протонов при гидролизе бензилпенициллина иммобилизованным химерным белком вызывает изменения проводимости, которые могут быть интерпретированы пользователем. Датчики содержат восемь чипов, организованных в четыре пары.

Каждый чип включает в себя три электрода, один рабочий электрод с полианилиновым покрытием, один электрод сравнения и один противоэлектрод. Для каждой пары чип с отрицательной маркировкой соответствует отрицательному контролю, тогда как чип с положительной маркировкой соответствует тестируемому образцу. Здесь показаны измерения проводимости, показывающие специфическое взаимодействие BlaP-cAb-Lys3 с HEWL.

Изменения проводимости являются результатом высвобождения протонов, вызванного гидролизом антибиотика иммобилизованной химерной бета-лактамазой. Не было обнаружено связывания с негативным контролем, нативной бета-лактамазой BlaP. После освоения эта техника может быть выполнена за 1/2 дня, если она выполнена должным образом и условия эксперимента оптимизированы.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что введение фрагмента антитела в BlaP является сложной задачей. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что качество генерируемых данных будет зависеть от функциональности химерной бета-лактамазы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, позволяющие количественно оценить обнаруженное взаимодействие с целью определения равновесной константы ассоциации этого взаимодействия.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунных биосенсоров для изучения молекулярных взаимодействий в различных образцах, начиная от живых организмов и заканчивая различными средами обитания. Применение этого метода распространяется на обнаружение многочисленных биомолекул, поскольку технология химерных бета-лактамаз является универсальным инструментом для функционализации любого антитела или фрагмента белка в сети. Таким образом, его можно использовать для разработки дешевых и быстрых диагностических инструментов во многих областях, таких как здоровье человека и животных.