Пептид Сканирование при содействии идентификации моноклональных антител узнаваемым Линейная B-клеточный эпитоп

Основная цель данного протокола — идентификация линейного B-клеточного эпитопа, распознаваемого моноклональным антителом, с помощью серийно усеченных рекомбинантных белков и пептидного сканирования методом дот-блот гибридизации. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся молекулярного взаимодействия между антигеном и антителом. Главными преимуществами данной методики являются ее простота и эффективность.

Затем идентифицированный эпитоп может быть использован в более детальных исследованиях, например, в терапевтических и диагностических целях. Процедуру продемонстрирует Чьен-Вэнь Чэнь, постдок из моей лаборатории. Для начала вырастите клетки мышиной моноклональной гибридомы RGM56 в гибридной среде без сыворотки.

Поддерживайте клеточные культуры в колбах T-175 при 37 °C и 5% CO₂. После пяти дней инкубации соберите культуральную среду, когда она станет желтой, и центрифугируйте супернатант при 4 500 ×g в течение 30 минут при 4 °C. Затем удалите осадок клеточного дебриса, чтобы получить антитела в растворе.

Затем добавьте два миллилитра 50% суспензии белка G в колонку объемом пять миллилитров и уравновесьте сорбент, используя 10 миллилитров ледяного PBS, что соответствует 10 объемам предварительно загруженного сорбента. Нанесите 200 миллилитров ранее приготовленного раствора антител на уравновешенную колонку и слейте фракцию, прошедшую сквозь колонку. Промойте колонку дважды, используя по 10 миллилитров ледяного PBS.

Наконец, для элюции антител из смолы добавьте в колонку 10 мл миллимолярного раствора глицерина при pH 2.7. Собирайте фракции по 900 µl в микроцентрифужные пробирки, предварительно заполненные 100 µl 10X нейтрализующего буфера. Храните очищенные антитела в 50% растворе глицерина с добавлением азида натрия при температуре -20 °C.

Подготовьте конструкции и проведите трансформацию клеток E.coli BL21, как описано в текстовом протоколе. Затем перенесите отдельную колонию в пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл бульона LB с добавлением 100 µg/ml ампициллина, и неплотно закройте пробирку крышкой. Инкубируйте культуру при 37 °C с встряхиванием при 150 RPM.

Контролируйте оптическую плотность культуры при 600 нанометрах. Когда она достигнет примерно 0,6, охладите культуру до 25 градусов Цельсия. Затем добавьте IPTG до конечной концентрации 0,4 миллимоляр для индукции экспрессии рекомбинантного белка.

Инкубируйте культуру еще четыре часа при 25 °C с встряхиванием при 200 RPM. После инкубации перенесите один миллилитр бактериальной культуры в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте клетки при 12 000 ×g в течение одной минуты и удалите супернатант.

Пипетируя вверх-вниз с помощью микропипетки, ресуспендируйте клеточный осадок в 100 microliters денатурирующего буфера. Затем перемешайте полученную суспензию путем интенсивного вортексирования, чтобы получить готовый к использованию образец рекомбинантного белка. Для проведения дот-блот гибридизации растворите каждый синтетический пептид в DMSO до получения растворов с концентрацией 10 mg/mL.

Затем активируйте мембрану PVDF в метаноле в течение двух минут и уравновесьте ее модифицированным буфером Тоубина еще в течение двух минут. Промойте фрагмент хроматографической бумаги модифицированным буфером Тоубина и поместите на нее уравновешенную мембрану PVDF. Оставьте мембрану до полного исчезновения буфера с ее поверхности.

С помощью наконечника объемом 10 µL нанесите по 2 µL каждого образца пептида или рекомбинантного белка на мембрану и дайте им высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Нанесение образцов на мембрану является наиболее критическим этапом данного протокола. Загрузка точного количества образца на небольшую область мембраны PVDF требует предельного внимания.

Затем заблокируйте мембрану в буфере TBST с добавлением 5% обезжиренного молока в течение 30 минут при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Разведите моноклональное антитело RGM56 в буфере TBST с добавлением 5% обезжиренного молока. Добавьте раствор антител на мембрану.

Инкубируйте мембрану при 37 °C в течение одного часа при осторожном встряхивании. После инкубации слейте раствор антител. Промойте мембрану дважды в буфере TBST по пять минут при осторожном встряхивании.

Затем нанесите на мембрану раствор вторичных антител, разведенный в буфере TBST с 5% обезжиренным молоком. Инкубируйте мембрану в течение одного часа при 37 °C при осторожном встряхивании. После инкубации слейте раствор антител и дважды промойте мембрану в буфере TBST по пять минут при осторожном встряхивании.

Затем проведите проявку мембраны с раствором субстрата при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте. При появлении сигнала остановите реакцию, промыв мембрану дважды дистиллированной водой. После высушивания мембраны на воздухе зафиксируйте изображение дот-блоттинга с помощью системы визуализации.

Наконец, с помощью программного обеспечения для анализа изображений измерьте интенсивность каждого дот-блота. Здесь представлены полноразмерный белок оболочки вируса некроза нервной ткани, состоящий из аминокислот с 1 по 338, а также его серийно усеченные варианты. Для подтверждения экспрессии белков в трансформированных бактериальных клетках был проведен анализ методом дот-блота с использованием антител anti-6XHis, который показал наличие всех исследуемых белков.

Затем рекомбинантные белки были проанализированы с помощью дот-блот гибридизации с использованием моноклонального антитела RG-M56. Анализ показал, что белковый эпитоп, распознаваемый антителом, находится в пептиде с 195 по 338 аминокислотный остаток. Наконец, методом пептидного сканирования был идентифицирован эпитоп, состоящий из 20 или восьми аминокислотных остатков.

Аланиновое сканирование показало, что замена остатков валина в позициях 197 и 199, а также цистеина в позиции 201, привела к потере способности эпитопа к связыванию и гибридизации в методе дот-блота. Аналогично, снижение аффинности связывания наблюдалось при анализе интенсивности связывания, что подтверждает необходимость данных остатков для связывания эпитопа с моноклональным антителом RGM56. Данный метод идентификации пептидов может быть использован для разработки терапевтических пептидных препаратов или пептидных лекарственных средств.