Использование ферментных биосенсоров на основе измерить Тоник и фазовый глутамат в мышиных моделях болезни Альцгеймера

Общая цель этой процедуры заключается в измерении тонических и фазовых внеклеточных изменений глутамата in vivo с использованием микроэлектродных матриц, сцепленных с ферментами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, изменяются ли уровни внеклеточных нейротрансмиттеров и быстрая динамика высвобождения и клиренса нейротрансмиттеров при заболеваниях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что микроэлектродные матрицы могут измерять конкретные изменения нейротрансмиттеров в дискретных областях мозга, что делает его пространственно и временным точным подходом, будучи при этом минимально инвазивным.

Демонстрировать процедуру будут Холли Хансбергер и Райан Хеслин из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, покройте пару сайтов записи на MEA желаемым ферментом, а другую пару сайтов записи — неактивной белковой матрицей. Затем наберите глутаматоксидазу или белковую матрицу с помощью шприца Hamilton объемом 10 микролитров.

Осторожно нажмите на поршень, чтобы выдать небольшую каплю раствора на кончике шприца. Чтобы нацелиться на сайты записи MEA, под препарирующим микроскопом нанесите раствор на соответствующие участки записи, кратковременно соприкоснувшись с местами записи каплей раствора, которая представляет собой один слой. Установите таймер на одну минуту между нанесением покрытия на места записи.

Теперь поместите электрод сравнения через отверстие в пластиковом кронштейне. Опустите электрод сравнения в стакан, содержащий PBS, и убедитесь, что он не соприкасается с нижней частью стакана. Затем подсоедините электрод сравнения к головному столику и подключите MEA к mPD, покрытому на головном столике.

Опустите MEA в стакан с раствором таким образом, чтобы только кончик MEA был погружен в раствор. Не погружайте наконечник MEA в жидкость за пределами черного пузыря. Это может привести к повреждению MEA.

Затем выберите значок гальванического покрытия на рабочем столе. В меню инструмента для гальванического покрытия убедитесь, что введены правильные настройки. После этого выберите выход из программного обеспечения, чтобы завершить гальваническое покрытие.

Промойте наконечники электродов с покрытием mPD деионизированной водой и храните в течение 24 часов перед калибровкой. При этом включите грелку на 37 градусов Цельсия и подключите головной столик к системе управления записью. Затем вставьте наконечник MEA в 40 миллилитров перемешанных 0,5 молярных PBS.

Затем подсоедините электрод сравнения к головному столику. Поверните наконечник электрода сравнения, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха. После этого откройте программу записи, убедитесь в правильности настроек, выберите номер MEA, нажмите «Калибровка» и нажмите «Пуск».

Подождите от пяти до 10 минут для балансировки и начните калибровку, как только базовый уровень стабилизируется. Далее выберите Базовый уровень и добавьте 500 микролитров аскорбиновой кислоты. Затем выберите Interferencent, когда течение достигнет нового устойчивого плато.

Если MEA правильно гальванизирован, никаких изменений наблюдать не должно. Далее добавьте 40 микролитров 20 миллимолярного L-глутамата. Как только течение достигнет нового устойчивого плато, отметьте первое добавление как аналит.

Повторите три раза, чтобы получить в общей сложности три добавления глутамата. Затем добавьте 40 микролитров дофамина. И выберите «Тестируемое вещество».

Впоследствии добавьте 40 микролитров перекиси. Выберите «Тестируемое вещество» и нажмите кнопку «Стоп» после завершения калибровки. На этом этапе поместите микропипетку по центру между всеми четырьмя платиновыми точками записи и установите ее на высоте от 50 до 100 микрометров над MEA с помощью липкого воска и пластилина.

С помощью адаптера постоянного тока прижмите красный положительный провод к подготовленному серебряному проводу со стороны золотого штифта, а черный отрицательный провод прижмите к платиновому катоду ванны. Затем подключите адаптер постоянного тока и найдите правильный процесс нанесения покрытия. На электроде ванны должны появиться пузырьки, а электрод сравнения должен стать серебристо-серого цвета.

При этой процедуре поместите животное в стереотаксическое устройство и используйте ушные планки для стабилизации его головы. Убедитесь, что животное закреплено и голова не двигается. Затем нанесите мазь для глаз с помощью стерильного ватного аппликатора.

После этого побрейте голову триммером. И удалите шерсть возле ушей с помощью небольших хирургических ножниц. Впоследствии нанесите на кожу головы йод, а затем спирт три раза поочередно.

После этого сделайте надрез посередине кожи головы и расправьте кожу. Стерильным ватным наконечником впитайте любую кровь и нанесите перекись водорода, чтобы облегчить появление брегмы и лямбды. Убедитесь, что голова расположена правильно, измерив дорсально-вентральную и медиально-латеральную части брегмы и лямбды.

Установите координаты на брегме равными нулю и отметьте координаты цели. Далее просверлите вокруг метки. После этого прикрепите MEA к головному столику.

Обратно заполните пипетку первым нужным раствором. Обязательно оставьте зазор в пипетке без раствора, чтобы выталкиваемый раствор можно было исследовать. Затем прикрепите трубку к стеклянной микропипетке.

Найдите брегму с прикрепленным MEA и установите координаты равными нулю. Переместите MEA в нужные координаты и медленно опускайте MEA, пока кончик не коснется мозга. Затем обнулите дорсально-вентральную координату, а затем медленно опустите MEA в мозг.

Поместите электрод сравнения в удаленном от MEA месте так, чтобы он все еще находился в контакте жидкости с мозгом для завершения цепи. В программе записи нажмите на нужный откалиброванный электрод, а затем нажмите «Выполнить эксперимент», чтобы начать запись. После получения стабильного базового уровня установите эжектор давления на 0,6 секунды и 0,5 фунта на квадратный дюйм и нажмите красную кнопку на эжекторе давления для выброса.

Записывайте время и давление, а также объемные такты, перемещенные на листе впрыска, и при необходимости делайте любые заметки. После этого извлеките MEA с прикрепленной микропипеткой, промойте его деионизированной водой и замочите в PBS на ночь, пока вся кровь не исчезнет. В областях CA3 и CA1 гиппокампа уровни тонизирующего глутамата были значительно повышены у мышей, получавших TauP301L, и этот эффект ослаблялся при лечении рилузолом.

Здесь исходные совпадающие репрезентативные записи вызванного высвобождением глутамата хлоридом калия в CA3 показали, что лечение рилузолом ослабляет значительное увеличение амплитуды высвобождения глутамата, наблюдаемое у мышей Vehicle-TauP301L. Местное применение хлорида калия привело к значительному увеличению внеклеточного глутамата, который быстро вернулся к тонизирующему уровню. Значительно повышенное содержание хлорида калия вызывало высвобождение глутамата в DG, CA3 и CA1, наблюдаемое у мышей, получавших TauP301L, после местного применения хлорида калия, которое было ослаблено при лечении рилузолом.

Этот окрашенный фиолетовым цветом участок гиппокампа подтверждает расположение следов MEA в CA3 и CA1. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о шагах по устранению неполадок, перечисленных в рукописи. Например, чтобы уменьшить шум сигналов, не забывайте заземлять систему и своевременно следуйте инструкциям.