Изготовление внеклеточного матрикса, производных Пены и микроносителями как Тканеспецифическая культуре клеток и платформ доставки

Общая цель данного протокола — помощь в определении размера нехимически сшитых пен или микроносителей, полученных из тканеспецифичного внеклеточного матрикса, для применения в моделях трехмерного (3D) культивирования клеток in vitro или в качестве про-регенеративных каркасов в системах доставки клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в областях прикладной клеточной биологии и тканевой инженерии, например, о том, как трехмерное клеточное микроокружение модулирует функции клеток и регенерацию тканей. Основным преимуществом данной методики является возможность изготовления каркасов с настраиваемой геометрией, которые имитируют состав нативного тканеспецифичного ECM и остаются стабильными при длительном культивировании без дополнительного сшивания.

После лиофилизации полученного из тканей внеклеточного матрикса (ECM) согласно текстовому протоколу, с помощью острых хирургических ножниц мелко измельчите децеллюляризированную ткань. Чтобы провести криоизмельчение обработанной ткани, заполните 25-миллилитровую стальную камеру измельчения для лабораторной шаровой мельницы измельченным лиофилизированным ECM и добавьте два стальных измельчающих шарика объемом 10 мл. Закройте загруженную камеру и полностью погрузите ее в жидкий азот на три минуты.

Затем измельчайте замороженный образец на мельнице с частотой 30 Гц в течение трех минут. Повторяйте погружение в жидкий азот и измельчение до тех пор, пока ВКМ не превратится в тонкий порошок. Отвесьте 250 мг измельченного или криоизмельченного ВКМ и перенесите его в центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Добавьте пять миллилитров 22 мМ буфера NaH2PO4 в центрифужную пробирку и отметьте уровень жидкости на пробирке. Затем приготовьте стоковый раствор альфа-амилазы, добавив 7,5 мг альфа-амилазы в один миллилитр 22 мМ буфера NaH2PO4. Далее добавьте 100 µL стокового раствора альфа-амилазы в образец.

Затем добавьте 22 молярный NaH2PO4 до достижения конечного объема 10 миллилитров. Непрерывно перемешивайте суспензию при 300 об/мин и комнатной температуре в течение 72 часов. Центрифугируйте суспензию при 1500 ×g в течение 10 минут.

Осторожно сберите и удалите супернатант, чтобы не потревожить осадок переваренного внеклеточного матрикса (ECM). Затем используйте 10 миллилитров 5% раствора NaCl, разведенного в дважды дистиллированной воде, чтобы ресуспендировать осадок, и непрерывно перемешивайте в течение 10 минут при 300 об/мин. Повторите промывку еще два раза, после чего используйте 10 миллилитров дважды дистиллированной воды для ресуспендирования осадка.

Затем непрерывно перемешивайте суспензию при 300 RPM при комнатной температуре в течение 10 минут. После повторного центрифугирования образца осторожно соберите и удалите супернатант, не затрагивая осадок переваренного ECM. Доведите объем до отметки пять миллилитров, добавив 2 молярную уксусную кислоту.

Затем перемешайте на вортексе. После этого подвергните суспензию непрерывному перемешиванию при 120 RPM и 37 °C в течение ночи. На следующий день с помощью ручного гомогенизатора, оснащенного зубчатым зондом шириной 10 мм, гомогенизируйте суспензию ВКМ при комнатной температуре интервалами по 10 секунд до полного исчезновения видимых фрагментов.

Чтобы предотвратить перегрев, помещайте суспензию в стакан с холодной водой в интервалах между этапами гомогенизации. Инкубируйте суспензию ВКМ при 37 °C при постоянном перемешивании со скоростью 120 RPM до ее нагрева. Затем используйте 2 М уксусную кислоту для разбавления суспензии образца до требуемой концентрации.

С помощью трехмиллилитрового шприца и иглы 18 G заполните выбранную форму суспензией ECM. Пенообразные структуры могут быть изготовлены в различных геометрических формах в зависимости от формы используемой формы. Закройте формы и заморозьте их при температуре -20 или -80 °C.

Затем поместите формы в колбу для лиофилизатора. Подключите колбу к лабораторной системе сублимационной сушки и сушите формы в течение 24 часов или до полного высыхания. Инкубируйте суспензию КМВ (ECM) после криоизмельчения при постоянном перемешивании со скоростью 100 RPM в течение ночи.

Загрузите 3 мл суспензии ECM в шприц с люэровским замком объемом 3 мл и присоедините бабочку (инфузионный набор с крыльями) к носику шприца. Зафиксируйте шприц в шприцевом насосе. Затем закрепите иглу на штативе и расположите кончик иглы вертикально на расстоянии 4–6 см от верхнего края сосуда Дьюара с низким профилем.

Затем прикрепите электрод с зажимом-«крокодилом» к кончику иглы, предварительно убедившись, что зажим подключен к положительному полюсу источника высокого напряжения. Сложите полоску алюминиевой фольги через край вакуумной колбы. Затем прикрепите второй электрод с зажимом-«крокодилом» к внешнему краю фольги.

Подключите его к заземляющему выводу источника питания. Заполните сосуд Дьюара жидким азотом примерно до уровня одного сантиметра от края, чтобы три четверти фольги были погружены в жидкость. Затем установите на шприцевом насосе скорость подачи 30 мл/ч и проведите электрораспыление образцов согласно текстовому протоколу.

После завершения заливки осторожно слейте избыток жидкого азота из сосуда Дьюара, оставив микроносители в примерно 25 миллилитрах жидкого азота, чтобы они оставались замороженными. Немедленно перенесите микроносители вместе с жидким азотом в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров одним плавным движением. Затем с помощью скупалы соберите все оставшиеся в сосуде Дьюара замороженные микроносители.

Также поместите их в центрифугу. Для подготовки к лиофилизации оберните центрифужную пробирку алюминиевой фольгой с небольшими отверстиями. Поместите обернутые центрифужные пробирки в колбу лиофилизатора.

Затем немедленно подсоедините колбу к лиофилизатору и сушите образцы в течение ночи. Осторожно перенесите лиофилизированную пену в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую избыток абсолютного этанола. Аналогичным образом ресуспендируйте лиофилизированные микроносители в избытке абсолютного этанола в той же центрифужной пробирке, которая использовалась для сбора.

С помощью серологической пипетки профильтруйте микроносители через стальную сито с определенным размером ячеек в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл, чтобы удалить агрегаты и отобрать частицы нужного размера. Инкубируйте образец при температуре четыре °C в течение четырех часов или до тех пор, пока пена или микроносители не осядут на дно центрифужной пробирки. Затем, в ламинарном шкафу, соблюдая правила асептики, с помощью серологической пипетки удалите абсолютный этанол из скаффолдов и добавьте избыток 95% этанола, разведенного стерильным PBS.

Инкубируйте скаффолды при температуре 4 °C в течение четырех часов или до тех пор, пока они не осядут на дно сосуда для регидратации. Постепенно регидратируйте скаффолды, используя серию растворов этанола. На каждом этапе инкубируйте скаффолды при температуре 4 °C до их оседания на дно сосуда, прежде чем заменять раствор.

Замените стерильный PBS дополнительными двумя промывками для удаления остаточного этанола. Храните образцы в 100% стерильном PBS при температуре четырех градусов Цельсия до начала культивирования клеток. Используйте скаффолды в течение одной-двух недель после регидратации.

Здесь представлены примеры типов пен и микроносителей на основе внеклеточного матрикса (ВКМ), изготовленных с использованием децеллюляризированной жировой ткани. Децеллюляризированная дерма свиньи и децеллюляризированный левый желудочек сердца свиньи. Это демонстрирует, что данные методы могут быть применены для создания тканеспецифических биокаркасов с использованием различных видов децеллюляризированных тканей в качестве источников ВКМ.

После криоизмельчения или измельчения, ферментативного переваривания и гомогенизации образцы можно перенести в чашу перед замораживанием и лиофилизацией. На данном рисунке представлены регидратированные пены DAT, DDT и DLV, синтезированные в формах 48-луночного планшета для культивирования тканей. Данные пены DAT, DDT и DLV были изготовлены с использованием криоизмельченного ECM в концентрации 35 mg/mL при температуре замораживания -80 °C.

Для изготовления микроносителей на основе внеклеточного матрикса (ВКМ) методом электрораспыления для каждой концентрации суспензии источника ВКМ можно подобрать диаметр иглы, скорость подачи и напряжение, чтобы получить отдельные сферические микроносители диаметром от 350 до 500 мкм после контролируемой регидратации. В конечном итоге, микроносители DAT, DDT и DLV, представленные здесь на снимках СЭМ, показывают, что ультраструктура и размер могут варьироваться в зависимости от источника децеллюляризованного ВКМ. Методы, представленные в данном видео, могут быть использованы для изготовления широкого спектра тканеспецифических микроносителей и пен из чистого, не подвергнутого химическому сшиванию ВКМ с использованием децеллюляризованной ткани в качестве матричного источника.

После выполнения этих процедур на пены и микроносители можно высевать клетки в статических или динамических условиях, и они могут быть использованы в качестве клеточно-инструктивного субстрата для культивирования клеток in vitro и применения in vivo.