Изготовление внеклеточного матрикса, производных Пены и микроносителями как Тканеспецифическая культуре клеток и платформ доставки

Общая цель данного протокола заключается в обеспечении размеров нехимически сшитых пенопластов или микроносителей, полученных из тканеспецифичного внеклеточного матрикса, для применения в 3D-моделях клеточных культур invitro или в качестве прорегенеративных каркасов в системах доставки клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области прикладной клеточной биологии и тканевой инженерии, например, о том, как трехмерная клеточная микросреда опосредует функцию клетки и регенерацию тканей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет изготавливать скаффолды с настраиваемой геометрией, которые имитируют специфический для нативной ткани состав ECM и стабильны в долгосрочной культуре без дополнительной сшивки.

После лиофилизации полученной ткани ВКМ в соответствии с текстовым протоколом используйте острые хирургические ножницы, чтобы мелко измельчить децеллюляризированную ткань. Чтобы криомилировать обрабатываемую ткань, заполните 25-миллилитровую фрезерную камеру из нержавеющей стали для лабораторной системы шаровых мельниц измельченным лиофилизированным ECM и добавьте два 10-миллилитровых фрезерных шара из нержавеющей стали. Закройте и полностью погрузите загруженную камеру измельчения в жидкий азот на три минуты.

Затем измельчите замороженный образец при температуре 30 Герц в течение трех минут. Повторите погружение в жидкий азот и измельчение до тех пор, пока ECM не превратится в мелкий порошок. Отвесьте 250 миллиграммов измельченного или криофрезерованного ЭБМ и переложите его в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Добавьте пять миллилитров 22-молярного буфера NaH2PO4 в пробирку центрифуги и отметьте уровень жидкости на пробирке. Затем приготовьте стоковый раствор альфа-амилазы, добавив 7,5 мг альфа-амилазы к одному миллилитру 22-молярного буфера NaH2PO4. Далее добавьте в образец 100 микролитров стокового раствора альфа-амилазы.

Затем добавьте 22 моляра NaH2PO4, чтобы получить итоговый объем в 10 миллилитров. Непрерывно перемешивайте суспензию при 300 об/мин и комнатной температуре в течение 72 часов. Центрифугируйте суспензию при 1500 умноженных на G в течение 10 минут.

Осторожно соберите и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая переваренную гранулу ECM. Затем используйте 10 миллилитров пятипроцентного NaCl, разведенного в двойной дистиллированной воде, для повторного взвешивания гранулированного материала и непрерывно перемешивайте в течение 10 минут при 300 об/мин. Повторите промывку еще два раза, прежде чем использовать 10 миллилитров двойной дистиллированной воды для повторного взвешивания гранул.

Затем непрерывно взбалтывайте суспензию со скоростью 300 об/мин при комнатной температуре в течение 10 минут. После повторного центрифугирования образца тщательно соберите и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая переваренную гранулу ECM. Добавьте 2 моляра уксусной кислоты до отметки в пять миллилитров.

И вихрь. Затем непрерывно взбалтывайте суспензию при 120 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день с помощью ручного гомогенизатора, оснащенного пилообразным щупом шириной 10 мм, гомогенизируйте суспензию ECM при комнатной температуре с интервалом в 10 секунд до тех пор, пока не останутся видимые фрагменты.

Поместите суспензию в стакан с холодной водой между интервалами гомогенизации, чтобы предотвратить перегрев. Инкубируйте суспензию ECM при температуре 37 градусов Цельсия с непрерывным перемешиванием при 120 об/мин до тех пор, пока суспензия не станет теплой. Затем с помощью 2 моляров уксусной кислоты разбавить образец суспензии до нужной концентрации.

С помощью трехмиллилитрового шприца и иглы 18 калибра заполните нужную форму суспензией ECM. Пенопласты могут быть изготовлены в различных геометриях в зависимости от формы формы. Накройте крышкой и заморозьте формочки при температуре минус 20 или минус 80 градусов по Цельсию.

Затем поместите формочки в колбу с лиофилизатором. Подключите колбу к лабораторной системе сублимационной сушки и высушите формы в течение 24 часов или до полного высыхания. Инкубируйте криофрезерованную суспензию ECM с непрерывным перемешиванием при 100 об/мин в течение ночи.

Загрузите три миллилитра суспензии ECM в трехмиллилитровый шприц с люэровским замком и прикрепите к отверстию шприца крылатый инфузионный набор. Закрепите шприц внутри шприцевого насоса. Затем закрепите иглу на ретортной подставке и расположите кончик иглы вертикально на расстоянии от четырех до шести сантиметров от верха низко сформированной колбы Дьюара.

Затем прикрепите электрод из крокодила-зажима к кончику иглы, также убедившись, что зажим из кожи аллигатора подключен к положительной клемме высоковольтного источника питания. Сложите полоску алюминиевой фольги над краем вакуумной колбы. Затем прикрепите второй электрод из кожи аллигатора к внешнему краю фольги.

Подключите его к клемме источника заземления блока питания. Наполните колбу Дьюара жидким азотом примерно на один сантиметр от верха так, чтобы три четверти фольги было погружено в воду. Затем установите шприцевой насос на скорость инфузии 30 миллилитров в час и распылите образцы электрооборудованием в соответствии с текстовым протоколом.

После завершения инфузии осторожно слейте излишки жидкого азота из сосуда Дьюара, оставив микроноситель взвешенным примерно в 25 миллилитрах жидкого азота, чтобы они оставались замороженными. Немедленно переложите микроносители с жидким азотом в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, заливая одним плавным движением. Затем используйте Scoopula, чтобы собрать все замороженные микроносители, оставшиеся в Dewar.

Добавьте их в центрифугу тоже. Чтобы подготовиться к лиофилизации, накройте центрифужную пробирку алюминиевой фольгой, перфорированной с небольшими отверстиями. Поместите закрытые центрифужные пробирки в колбу для лиофилизатора.

Затем сразу же подключите колбу к лиофилизатору и просушите образцы в течение ночи. Аккуратно переложите лиофилизированную пену в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую избыток абсолютного этанола. Аналогичным образом, повторно суспендируйте лиофилизированные микроносители в избыточном количестве абсолютного этанола в исходной центрифужной пробирке, используемой для сбора.

С помощью серологической пипетки отфильтруйте микроносители через нержавеющее сито с определенным размером ячеек в новую центрифугу объемом 50 миллилитров, чтобы удалить все заполнители и выбрать желаемые диапазоны размеров. Инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех часов или до тех пор, пока пена или микроносители не осядут на дно центрифужной пробирки. Затем под ламинарным проточным колпаком с помощью асептической техники с помощью серологической пипетки удалите абсолютный этанол из каркасов и добавьте избыток 95% этанола, разбавленного стерильным PBS.

Инкубируйте каркасы при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех часов или до тех пор, пока каркасы не опустятся на дно сосуда для регидратации. Постепенно увлажняйте каркасы с помощью этанола. На каждом этапе инкубируйте каркасы при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не опустятся на дно сосуда, прежде чем менять раствор.

Замените стерильный PBS еще двумя полосканиями для удаления остатков этанола. Храните образцы в 100% стерильном PBS при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к культивированию клеток. Используйте каркасы в течение одной-двух недель после регидратации.

Здесь приведены примеры типов пенопластов и микроносителей, полученных из ВКМ, изготовленных с использованием децеллюляризованной жировой ткани. Свинья децеллюляризировала дермальную ткань, а свинья децеллюляризировала левый желудочек. Демонстрация методов может быть применена для создания тканеспецифичных биоскаффолдов с использованием различных децеллюляризованных тканей в качестве источников ВКМ.

После криомиллинга или измельчения, ферментативного сбраживания и гомогенизации образцы могут быть выданы в чашу перед замораживанием и лиофилизацией. На этом рисунке представлены регидратированные пенопласты DAT, DDT и DLV, синтезированные в 48-луночной пресс-форме для культивирования тканей. Эти пенопласты DAT, DDT и DLV были изготовлены из криофрезерованного ECM в концентрации 35 миллиграммов на миллилитр и температуре замерзания минус 80 градусов Цельсия.

Для изготовления микроносителей, полученных из ЭХМ, с использованием метода электрораспыления, для каждого источника ЭХМ концентрация суспензии, скорость инфузии игольчатого датчика и напряжение могут быть настроены на создание дискретных сферических микроносителей диаметром от 350 до 500 микрометров после контролируемой регидратации. Наконец, показанные здесь с помощью SEM микроносители DAT, DDT и DLV показывают, что размер ультраструктуры может варьироваться в зависимости от децеллюляризованного источника ECM. Методы, представленные в этом видео, могут быть использованы для изготовления разнообразного набора тканеспецифичных микроносителей и пенопластов, состоящих из чистой, не сшитой химически сшитой ВКМ с использованием децеллюляризованной ткани в качестве источника матрицы.

После этих процедур пены и микроносители могут быть засеяны клетками в статических или динамических условиях и могут быть применены в качестве клеточного инструктирующего субстрата для клеточных культур invitro и применений invivo.