Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на A. fumigatus

Общая цель этой процедуры заключается в оценке противогрибковой активности первичных иммунных клеток человека в режиме реального времени с использованием флуоресцентных аспергиллезных репортерных конидий и видеомикроскопии живых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся иммунных реакций против грибковых инфекций в конкретных популяциях пациентов и, в частности, врожденного иммунного ответа, возникающего на ранних этапах контакта с грибами. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть использована для выявления специфических дефектов врожденного и противогрибкового иммунитета, таких как фагоцитоз, миграция клеток, убивающая ингибирование роста грибков.

Для начала рассейте штамм аспергиллуса фумигатуса AF293, несущий флуоресцентный репортерный ген dsRed, над агаром, приготовленным в двух колбах T75. Инкубируйте культуры при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение семи дней, чтобы получить примерно от 10 до 9-й конидии. После инкубации погрузите культуры в 20 миллилитров PBS с 0,05%Tween 80 и соберите A fumigatus conidia.

Затем с помощью клеточного фильтра 40 микрометров отфильтровать полученные суспензии в 50 миллилитровую пробирку для удаления гифальных фрагментов. После того, как суспензии будут отфильтрованы, центрифугируйте их при 805 умноженных на G в течение 10 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 20 миллилитрах стерильного PBS.

Наконец, объедините образцы и центрифугируйте полученную суспензию еще раз. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах PBS и переложите один миллилитр аликвоты полученной конидиальной суспензии в микроцентрифужные пробирки. Центрифугируйте аликвоты при 9, 300 умноженных на G при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем осторожно отсадить надосадочную жидкость и ресуспендировать конидиальную гранулу в одном миллилитре 0,05 молярного гидрокарбоната натрия с PH 8,3. Чтобы пометить конидии, добавьте в микроцентрифужную пробирку 10 микролитров стокового раствора биотина, накройте образец алюминиевой фольгой и выдержите в течение двух часов на коромысле при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования меченого биотином образца в течение 10 минут при 9, 300 кратном G осторожно удалите надосадочную жидкость.

Затем ресуспендируйте конидиальную гранулу в одном миллилитре 100 микромолярного раствора Tris-HCL с PH 8,0. И инкубируйте эту суспензию при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа с легким помешиванием, чтобы дезактивировать неограниченный биотин. Центрифугируйте образец при 9, 300 умноженных на G в течение 10 минут.

Аккуратно удалите образовавшуюся надосадочную жидкость, промойте гранулу одним миллилитром стерильного ПБС и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре ПБС. Затем добавьте 10 микролитров стокового раствора Стрептавидин-AF633 в один миллилитр конидиальной суспензии. Инкубируйте эту суспензию, накрытую алюминиевой фольгой, в течение 40 минут при комнатной температуре на коромысле.

Центрифугируйте образец при 9, 300 умноженных на G в течение 10 минут. Затем осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте конидиальную гранулу в одном миллилитре PBS. С помощью гемоцитометра подсчитайте конидии в разведении от одного до 1000, а затем отрегулируйте конидию в 3,6 раза по 10 до 6-й конидии на миллилитр с CO2-независимой средой.

Наконец, заверните суспензию в фольгу и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Соберите и разбавьте образец человеческой крови с помощью PBS. Затем с помощью шприца с железной иглой подложить под образец крови 15 миллилитров среды для выделения мононуклеарных клеток.

Центрифугируйте образец при перегрузке в 630 раз больше G в течение 20 минут без перерыва и с низким ускорением. Соберите с помощью пастеровской пипетки центральный слой PBMC, локализованный между желтой сывороткой и прозрачным слоем раствора для выделения лимфоцитов. Затем собранную суспензию переложите в новую 50 миллилитровую трубку.

Разведите ПБМК с ПБС до получения 50 миллилитров суспензии и промойте клетки. После промывания смешайте 20 микролитров клеточной суспензии со 160 микролитрами PBS и 20 микролитрами трипанового синего и подсчитайте клетки гемоцитометром. После подсчета разбавьте до соответствующей концентрации в 15-миллилитровой пробирке, центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 515-кратном G, а затем повторно суспендируйте их, используя 40 микролитров буферного раствора из расчета один умножить на 10 до 7-й клетки.

Добавьте 10 микролитров CD14 MicroBeads из расчета один раз по 10 в 7-ю ячейку и хорошо перемешайте. Инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут, перемешивая пробирку каждые пять минут. После конъюгации промыть клетки в одном миллилитре буферного раствора из расчета на 10 до 7-х клеток и центрифугировать суспензию при 515 умноженных на G в течение 10 минут.

Затем ресуспендируют до одного раза по 10 до 8-х клеток в 500 микролитрах буферного раствора. Установите одну колонку, которая будет использоваться с одним образцом, на магнитный сепаратор, следуя инструкциям производителя, и промойте колонку один раз 500 микролитрами буферного раствора. Загрузите на колонку 500 микролитров клеточной суспензии.

Как только он высохнет, трижды промойте колонку буферным раствором. Поместите новую трубку объемом 15 миллилитров под колонку и отсоедините колонку от магнитного сепаратора. Затем с помощью одного миллилитра буферного раствора вымывают клетки из колонки в пробирку.

Промойте и повторно суспендируйте элюированные клетки в среде RPMI. После регулировки плотности клеток до шести умно-10 до 5-х клеток на миллилитр, засейте 200 микролитров суспензии на 35-миллиметровой стеклянной чашке для визуализации. Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2.

Чтобы изолировать нейтрофилы, удалите всю сыворотку и большую часть раствора для выделения лимфоцитов из образца крови, оставшегося после забора PBMC. Следите за тем, чтобы не удалить тонкую белую полосу поверх красной гранулы. Удерживая клетки на льду, затем лизируйте эритроциты и центрифугируйте оставшиеся нейтрофилы при 394-кратном G. Затем дважды промойте клетки холодным PBS, а затем повторно суспендируйте в одном миллилитре CO2-независимой среды.

Для проточной цитометрии отрегулируйте плотность клеток до шести умно-10 до 5-х клеток на миллилитр и добавьте 400 микролитров клеточной суспензии в 24-луночный планшет. Добавьте 200 микролитров той же клеточной суспензии в 35-миллиметровую стеклянную чашку для визуализации для микроскопического исследования. Чтобы визуализировать dsRed и Alexa Fluor 633 во время микроскопии, нагрейте нагреватель микроскопа и включите микроскоп и компьютер.

Далее добавьте 100 микролитров трижды по 10 к 6-му на миллилитр конидиальной суспензии FLARE в соответствующие лунки тепловизионной чашки. Запишите время добавления конидий FLARE. Установите чашку для визуализации на предметный столик микроскопа, затем в настройках сбора данных установите мощность лазера на 10% и время экспозиции на одну секунду.

И отрегулируйте чувствительность камеры для четкого, но не пересвеченного изображения dsRed и AF633 и настройте список точек этапа. Инициализируйте визуализацию, когда все точки находятся в фокусе, флуоресцентные каналы оптимизированы, а время и продолжительность цикла заданы. Здесь представлены изображения, сделанные во время одновременного культивирования нейтрофилов и FLARE conidia.

Зеленый флуоресцентный сигнал, соответствующий окрашиванию AF633, виден как в живых, так и в мертвых конидиях. В то время как dsRed флуоресценция может наблюдаться исключительно у живых конидий. Таким образом, среди всех обнаруженных конидий только те, которые одновременно окрашены обоими красителями и видны как пурпурные пятна, являются живыми.

Фагоцитоз и уничтожение A fumigatus conidia, совместно культивируемого с клетками альвеолярных макрофагов мыши, количественно оценивали с помощью проточной цитометрии. В анализе макрофаги-свидетели помечены оранжевым затвором, в то время как макрофаги, связанные с мертвыми конидиями и положительные только на окрашивание AF633, показаны внутри синего затвора. Кроме того, у мертвых конидий не выявлено калькофторное окрашивание белым цветом, что указывает на их внутриклеточную локализацию.

Живые конидии, окрашенные как dsRed, так и AF633, помечены красными воротами, эти конидии также интернализованы в клетках макрофагов, о чем свидетельствует уменьшенное окрашивание калькофтором белым. Наконец, было оценено влияние A. fumigatus на миграцию нейтрофилов человека, что выявило увеличение движения и скорости иммунных клеток в ответ на набухшие конидии по сравнению с покоящимися конидиями. После освоения эта техника может быть выполнена за восемь часов для популяции одной клетки.

Выполняя эту процедуру, важно помнить о том, что клетки должны оставаться на льду. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как измерение активных форм кислорода или цитокинез, чтобы получить дополнительную информацию о врожденном противогрибковом иммунном ответе в той же клеточной популяции. После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области грибковой иммунологии к изучению фагоцитоза и уничтожения противогрибковых препаратов с использованием грибковых патогенов в первичных иммунных клетках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценить врожденные противогрибковые иммунные реакции первичных иммунных клеток человека в режиме реального времени с помощью флуоресцентной конидии Aspergillus Reporter и видеомикроскопии живых клеток. Не забывайте, что работа с человеческой кровью может быть опасной, и всегда следует принимать соответствующие меры предосторожности для предотвращения передачи инфекции.