Анализ терминации транскрипции с помощью BrUTP прядей специфичную Транскрипция выбега (TRO) подход

Общая цель этой процедуры заключается в изучении прекращения транскрипции РНК-полимеразой у почковающихся дрожжей в условиях in vivo путем запуска специфической цепи транскрипции на подходе. Этот метод помогает ответить на ключевой вопрос о том, является ли транскрипционно активная полимераза, обнаруженная за пределами трех основных концов гена, полимеразой, инициируемой промоторной областью. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может отличить полимеразу, транскрибирующую мРНК, от широко транскрибирующей полимеразы, которая инициировала транскрипцию и будет находиться на трех основных концах гена.

Этот метод может быть расширен для изучения прекращения транскрипции другими РНК-полимеразами и дрожжами из-за консервативной природы терминации различными полимеразами. Хотя этот метод может дать представление о точной роли факторов терминации в цикле транскрипции дрожжей, он также может быть расширен для изучения терминации у высших эукариот. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности с перцеабилизацией клеток и транскрипцией, так как они требуют тщательного выполнения, а зарождающиеся транскрипты также могут быть трудно очистить.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову благодаря подходу GRO seek, который дает полногеномный снимок положения транскрипционно активных полимераз специфическим для цепи способом. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как транскрипция и очистка РНК затруднены из-за малого количества и нестабильной природы зарождающихся транскриптов. Перед началом реакции транскрипции выращивайте, собирайте и пермеабилизируйте экспоненциально растущие дрожжевые клетки, чтобы получить пермеабилизированную клеточную палитру.

Чтобы начать реакцию, добавьте в пеабилизированную клеточную палитру 150 микролитров транскрипции, запущенной на буфере. С помощью усеченного наконечника P-200 аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Поместите образец на лед.

После того, как все образцы были повторно суспендированы в режиме транскрипции на буфере, инкубируйте образцы в течение пяти минут при температуре 30 градусов Цельсия на водяной бане. Остановите реакцию, добавив в каждый образец 500 микролитров холодного готового к использованию реагента для выделения РНК. Выдерживать в течение пяти минут при комнатной температуре.

Начните процедуру экстракции РНК, добавив 200 микролитров промытых кислотой стеклянных шариков в каждую клеточную суспензию и энергично встряхивая в вихревом миксере в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Через 20 минут с помощью горячей иглы 22 калибра проколите дно каждой микроцентрифужной пробирки и поместите пробирку на верхнюю часть стерильной конической пробирки объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте при 300 умноженных на G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия и перенесите лизат клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте в лизат клеток 500 микролитров реагента для выделения холодной РНК, и 200 микролитров хлороформа. Смешайте содержимое на вихревом миксере, а затем центрифугируйте при 16, 168 перегрузках в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите верхнюю водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку.

Добавьте равный объем холодного фенола, хлороформа, изоамилового спирта. Энергично встряхните на вихревом миксере, а затем центрифугируйте при 16, 168 перегрузках в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите верхнюю водную фазу, содержащую РНК, в новую микроцентрифужную пробирку.

Добавьте равный объем холодного фенола, хлороформа, изоамиловый спирт, вортекс и снова центрифугу. К конечной РНК, содержащей водную фазу, добавляют соответствующий объем пятимолярного запаса хлорида натрия, чтобы получить конечную концентрацию 0,3 моляра. Добавьте в три раза больше объема холодного этанола, чтобы осаждать РНК.

Инкубируйте в течение одного часа или в течение ночи при температуре 20 градусов Цельсия. Когда осаждение РНК завершено, центрифугируйте при 16, 168 перегрузках в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте палитру РНК в 100 микролитрах воды DEPC.

Используйте набор для выделения РНК, чтобы отделить РНК от неинкорпорированных нуклеотидов бромуридинтрифосфата и элюировать РНК из колонки 100 микролитрами свободной РНК-азы воды. Инкубируйте РНК на водяной бане при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут. А затем переложите на лед не менее чем на две минуты.

Начните эту процедуру с подготовки гранул антибромо DU во время осаждения РНК. Для каждого образца добавьте 500 микролитров 0,25 X буфера связывания ЭДТА с солевым раствором натрия и 25 микролитрами осевших гранул. Центрифугируйте при температуре 200 умноженных на G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость.

Вымойте бусины три раза с помощью связующего буфера. После удаления надосадочной жидкости с третьей промывки добавьте 500 микролитров блокирующего буфера в бусины и аккуратно встряхивайте в течение одного-двух часов при четырех градусах Цельсия на платформенном шейкере. Промойте бусины еще два раза 500 микролитрами связующего буфера.

Снимите надосадочную жидкость со второй промывки и добавьте в бусины 400 микролитров связующего буфера. Перенесите 100 микролитров РНК непосредственно на бусины. Выдерживайте с легким встряхиванием в течение одного-двух часов при температуре четыре градуса Цельсия на платформе.

Вращайте при температуре 200 раз G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия, а затем удалите надосадочную жидкость. Далее добавьте в бусины 500 микролитров связующего буфера. Вращайте при температуре 200 G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость.

Таким образом, последовательно промойте бусины связующим буфером, буфером с низким содержанием солей, буфером с высоким содержанием соли и дважды с буфером ТЕТ. Чтобы вымыть меченую бромуридинтрифосфатом РНК из гранул, добавьте 150 микролитров элюирующего буфера и инкубируйте в течение четырех минут при температуре 42 градуса Цельсия на водяной бане. Ненадолго поверните вниз и соберите надосадочную жидкость.

Таким образом, дважды последовательно разбавьте 150 микролитрами и один раз 200 микролитрами элюирующего буфера. Из каждого образца должно быть получено около 500 микролитров аффинной очищенной РНК, меченной бромуридинтрифосфатом. Для осаждения сродства очищенной бромуридинтрифосфатной меченой РНК добавляют в каждый образец 500 мкл холодного фенола, хлороформа, изоамилового спирта.

Вихревой и центрифугируйте при 16, 168 перегрузках в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите верхнюю водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку. Добавьте соответствующий объем пятимолярного запаса хлорида натрия, чтобы получить конечную концентрацию 0,3 моляра.

Затем добавьте в три раза больше объема холодного этанола. Инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы выпасть в осадок РНК. На следующий день соберите осажденную РНК центрифугированием при 16, 168 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Снимите надосадочную жидкость и дайте палитре высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Ресуспендируйте палитру РНК в 26 микролитрах воды DEPC. Определите конечную концентрацию РНК, измерив поглощение на глубине 260 нанометров с помощью спектрофотометра.

Храните образцы РНК и аликвоты при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся для синтеза кДНК. Для проверки потребности РНК 14 в прекращении транскрипции гена ASC1 у почковающихся дрожжей был использован подход, специфичный для транскрипции бромуридинтрифосфатной цепи. Меченую бромуридинтрифосфатом РНК мутантной РНК 14-1 и ее изогенных клеток дикого типа очищали и обратному транскрибированию с помощью праймеров C, D, E, F и G. Соответствующую кДНК амплифицировали с использованием праймерных пар B и C, B и D, B и E, B и F, B и G, а также фракционировали на агарозных гелях.

Наличие амплифицированных ПЦР продуктов из праймерных пар B и E, B и F, а также B и G у мутанта отражает фенотип терминирующего считывания. Однако в клетках дикого типа транскрипция сигнала была ограничена терминаторным элементом, и не было обнаружено обнаруживаемой транскрипции сигнала за пределами терминаторной области. На этом графике показано количественное определение гелей с пятью S-РНК в качестве контроля нормализации.

Обнаружение инициированных промотором зарождающихся транскриптов, которые считывают сигнал терминации в мутантных, но не в клетках дикого типа, подтверждает, что РНК 14 является фактором терминации. После освоения этой техники ее можно сделать за три дня. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что прогон транскрипции по реакции имеет решающее значение для получения успешного результата.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как поиск GRO, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как роль фактора терминации в масштабах всего генома. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области транскрипции к изучению терминации другими РНК-полимеразами в дрожжевых и высших эукариотических системах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить транскрипцию, прогонять реакции и очищать зарождающиеся меченые расшифровки.

Не забывайте, что РНК может быть крайне нестабильной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, поддержание температуры около четырех градусов Цельсия и использование свободных агентов РНКазы.