Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

Общая цель данной процедуры заключается в определении структуры высокомолекулярных комплексов путем анализа отдельных частиц данных электронной криомикроскопии с использованием программного обеспечения для обработки изображений SPHIRE. Крио-ЭМ одиночных частиц становится основной технологией для изучения структур макромолекул с разрешением, близким к атомному. SPHIRE — это новый программный пакет, который обеспечивает полуавтоматическую обработку данных крио-ЭМ в удобной для пользователя форме.

Основным преимуществом SPHIRE является механизм автоматической проверки. Большинство процедур необходимо выполнить только один раз, а результаты объективны и воспроизводимы. Крио-ЭМ с высоким разрешением может быть использован для размещения отдельных остатков, тем самым обеспечивая решающее понимание организации и функционирования сложных микромолекулярных машин.

Новички в этом методе должны иметь в виду, что получение структуры с высоким разрешением в значительной степени зависит от качества образца и входных данных. Чтобы начать работу с приложением PHIRE, откройте графический интерфейс пользователя из терминала. Откройте УТИЛИТЫ, чтобы отобразить изображение криомикроскопии с помощью e2display.

Используйте встроенный инструмент измерения для измерения самой длинной оси частицы в ангстреме на пиксель. Откройте Настройки проекта. Установите размер окна CTF по крайней мере на размер поля частиц.

Установите размер коробки для частиц на четное число, по крайней мере в 1 1/2 раза больше диаметра частицы. Установите радиус частицы как минимум на половину измеренной длины. Введите симметрию точечных групп, если она известна, и приближенную молекулярную массу.

Зарегистрируйте настройки. Далее в меню MOVIE откройте выравнивание фильма Micrograph. Задайте пути к исполняемым файлам unblur и summovie.

Выберите необработанный невыровненный фильм с микрофотографией и замените переменную имени файла на подстановочный знак, чтобы задать шаблон пути к входной микрофотографии. Присвойте имя выходному каталогу. Укажите количество кадров фильма, напряжение микроскопа и покадровую экспозицию.

Запустите процесс для создания взвешенных по дозе и невзвешенных по дозе средних микрофотографий с коррекцией движения. Затем откройте меню CTER и выберите пункт Оценка CTF. Установите в качестве входных данных микрофотографии без взвешивания дозы.

Назовите выходной директорию и заполните параметры сбора данных. Установите наименьшую частоту равным 0285 обратным ангстремам, а максимальную частоту — 0,285 обратного ангстрема. Запустите процесс для создания списка параметров CTF.

Затем откройте меню WINDOW и выберите Particle Picking. Установите в качестве входных данных дозовзвешенные микрофотографии и запустите утилиту e2boxer. Выполняйте сбор частиц вручную или автоматически.

Извлеките выбранные частицы в стеки изображений и объедините их в один виртуальный стек образов в базе данных BDB. После того как частицы будут отобраны и уложены, откройте меню ISAC и выберите ISAC 2D Clustering. Установите стек виртуальных образов в базе данных BDB в качестве входных данных.

Оцените количество изображений в классе. Заполните оставшиеся параметры и сгенерируйте средние значения 2D класса. После завершения 2D-классификации используйте утилиту Отобразить данные для просмотра проверенных воспроизводимых средних классов.

Убедитесь, что представлены несколько ориентаций частиц и что средние значения по классам имеют удовлетворительное качество. Сгенерируйте новый стек виртуальных образов, содержащий только частицы, принадлежащие к проверенным средним значениям класса. Затем откройте меню VIPER и используйте утилиту Display Data для просмотра средних значений по классу.

Удалите средние значения по классам низкого качества или с идентичными представлениями частицы. Сохраните оставшиеся средние значения по классу в новый файл. Затем выберите Исходная 3D-модель RVIPER и используйте небольшую выборку средних значений классов в качестве входных данных.

Выполните команду для создания исходной воспроизводимой 3D-модели белка. Осмотрите модель в программе молекулярной графики Chimera. Сравните модель с известной структурой гомологичного белка или домена из интересующего белка.

Вернитесь в меню VIPER в SPHIRE и выберите «Создать 3D-образец». Создайте исходную 3D-модель с правильным размером пикселя и 3D-маской. Откройте меню MERIDIEN и выберите опцию 3D Уточнение.

Заполните стек входных изображений и пути к исходному файлу 3D-образа. Присвойте выходной директории имя и задайте маску опорной модели в качестве 3D-маски. Выберите Применить жесткую 2D-маску.

Установите начальное разрешение в диапазоне от 20 до 25 ангстрем и запустите 3D-уточнение, чтобы получить неотфильтрованные полуобъемы. Затем просмотр в нефильтрованном полуобъеме в Chimera. Определите порог бинаризации, при котором все плотности белков связаны, но артефакты шума не связаны.

Вернитесь в меню MERIDIEN в SPHIRE и откройте Адаптивную 3D Маску. Введите нефильтрованный полуобъемный вход и порог бинаризации. Назовите выходную маску и запустите процесс создания 3D-маски с мягкими краями.

Затем откройте Повышение резкости и выберите оба неотфильтрованных полутома. Установите полуобъемную 3D-маску с мягким краем в качестве маски, предоставленной пользователем. Запустите процесс, который объединяет полутома, а затем фильтрует и повышает резкость объединенного тома.

Откройте файл журнала, чтобы просмотреть окончательную оценку разрешения. Создание 3D-карты углового распределения частиц в стеке входных изображений, созданном во время 3D-уточнения. Откройте заточенную и отфильтрованную 3D модель в Chimera.

Изучите карту плотности и ее функции с высоким разрешением. Откройте угловое распределение в Химере и убедитесь, что углы Эйлера распределены изотропно. Откройте меню SORT3D и выберите пункт Оценка 3D-изменчивости.

Создание 3D-карты изменчивости на основе виртуального стека изображений частиц, принадлежащих к проверенным средним значениям класса. Сгенерируйте бинаризованную 3D-маску на основе этой карты изменчивости для последующей сфокусированной 3D-кластеризации. Затем откройте RSORT3D 3D-кластеризации и выберите директорию предыдущей 3D-доработки в качестве входных данных.

Присвойте имя выходному каталогу и задайте глобальную и сфокусированную 3D-маски. Используйте не менее 5 000–10 000 изображений в группе для больших наборов данных. Запустите процесс сортировки для создания объемов каждой однородной 3D-группы.

Используйте Химера для определения структуры с самым высоким видимым разрешением. Вернитесь в меню SORT3D в SPHIRE и откройте Локальное уточнение подмножества. Задайте путь к файлу кластера идентификаторов частиц в подмножестве в соответствии со структурой с наивысшим разрешением.

Установите в качестве каталога 3D-уточнения каталог, содержащий неотфильтрованные полутома, и перезапустите итерацию до итерации с самым высоким разрешением из предыдущей 3D-детализации. Выполните команду для создания локальных неотфильтрованных полутомов. Затем создайте 3D-маску с мягкими краями из одного из локальных полуобъемов.

Объедините локальные полутома и увеличьте резкость объединенного объема без применения фильтра нижних частот. Затем откройте меню LOCALRES и нажмите «Локальное разрешение». Выберите локальные полутома.

Затем выберите локальную маску с мягкими краями. Установите общее разрешение на абсолютное разрешение, оцененное при повышении резкости объединенного локального объема. Рассчитайте локальное разрешение объема.

Затем откройте 3D Локальный фильтр. Установите в качестве входных данных локальную громкость без фильтрации резкости. Выберите карту с локальным разрешением и 3D-маску с мягкими краями.

Примените фильтр локального разрешения к увеличенному объему, чтобы создать окончательную 3D-модель. Откройте полученную карту объема и локального разрешения в Chimera. Запустите инструмент «Цвет поверхности» и выберите объем в меню, а также опцию для окрашивания поверхности в соответствии с локальным разрешением.

Токсинный комплекс TcdA1 визуализировали с помощью криомикроскопии. На всех изображениях были четко различимы одиночные частицы и кольца Тона, простирающиеся с разрешением лучше четырех ангстрем в спектре мощности. Частицы были отобраны с помощью e2boxer, а затем извлечены в стек изображений.

Двумерные средние значения классов были получены с помощью итеративного стабильного выравнивания и кластеризации, или ISAC. Эти средние значения по классу были использованы для расчета воспроизводимой 3D-модели с помощью RVIPER. Эта модель хорошо согласуется с ранее решенной кристаллической структурой TcdA1.

Автоматическое 3D-уточнение этой модели с использованием MERIDIEN позволило получить почти атомное разрешение, map. 3D анализ изменчивости показал локализованную гибкость N-концевой области, помеченной гистидином, рецептор-связывающих доменов и TcB-связывающего домена. Были выполнены расчеты с локальным разрешением.

Более резкая модель была локально отфильтрована и применена цветовая шкала, соответствующая местному разрешению, показывающая топологическое соответствие между областями высокой изменчивости и областями с низким разрешением. Окончательная крио-ЭМ структура TcdA1 с разрешением 3,5 ангстрема показала четкую плотность для большинства боковых цепей. Карта плотности с таким уровнем детализации может быть в дальнейшем использована для построения атомных моделей de novo.

Используя этот подход, структура с почти атомным разрешением может быть получена в течение нескольких часов или нескольких дней, без априорной структурной информации. При попытке выполнить эту процедуру используйте только качественные данные и проверяйте промежуточные результаты. Композиционная и структурная неоднородность крио-ЭМ образца может быть ограничивающим фактором для достижения околоатомного разрешения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать SPHIRE для крио-ЭМ структурного определения. Как вы уже видели, процедуры кластеризации, включенные в PHIRE, позволят вам не только решить структуру интересующего вас белка, но и изучить конформационную динамику и обеспечить решающее механистическое понимание сложных молекулярных механизмов.