Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов Микобактерии туберкулеза

Новые модели и анализы, которые могли бы улучшить процесс ранней разработки лекарств для противотуберкулезных препаратов следующего поколения, крайне желательны. В данной статье мы описываем быстрый, недорогой и совместимый с BSL-2 анализ для оценки эффективности препарата против Mycobacterium tuberculosis, который может быть легко адаптирован для высокопроизводительного скрининга.

Общая цель этой процедуры заключается в воспроизводимом получении агрегированных структур макрофагов, инфицированных микобактериями туберкулеза, в формате 96-луночных планшетов для тестирования чувствительности к лекарственным препаратам с использованием красителя жизнеспособности. Этот метод может улучшить процесс ранней разработки лекарств для противотуберкулезных соединений, что затрудняется непродуктивной трансляцией соединений-кандидатов в клинические условия. Основное преимущество этой простой, недорогой, совместимой с BSL 2 модели инфекции заключается в том, что она повторяет физиологически значимые клеточные барьеры проникновения, напоминающие туберкулезные гранулемы.

Это делает результаты чувствительности к препаратам более предсказуемыми для эффективности in vivo. Начните эту процедуру с получения зеленого флуоресцентного белка, экспрессирующего M.tuberculosis MC в квадрате 6206, далее именуемого MTBGFP, для инфекции. Имейте в виду, что это авирулентный штамм, поэтому все работы в описанном здесь протоколе могут быть выполнены на объекте второго уровня биобезопасности.

Для каждой 96 луночной плиты необходимо установить центрифугу при 2,8 умножить на 10 до восьмой МТБГФП при 3, 200 раз G в течение пяти минут в качающемся ведре центрифуги. После отжима аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте пять миллилитров RPMIC для вымывания бактерий. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы снова суспендировать ячейку.

Затем снова центрифугу. После второго отжима слейте надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактериальные клетки в семи миллилитрах RPMIC, после чего сделайте вихрь в течение 10 секунд. Затем для каждого планшета с 96 лунками, который должен быть установлен, центрифугируйте семь раз по 10 до шестой THP1 моноцитарных клеток человека в 250 раз больше G в течение пяти минут.

После центрифугирования слить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки THP1 в семи миллилитрах RPMIC. Затем подготовьте 96 луночную пластину для заражения, добавив 200 микролитров стерильной воды в лунки в рядах А и Н и столбцах 1 и 12. Такой ободок для воды предотвратит испарение питательной среды.

Добавьте 200 микролитров RPMIC во второй столбец, B два в G два, для управления фоном или бланком. Чтобы инфицировать моноцит THP1, используйте пипетку, чтобы перенести всю приготовленную бактериальную суспензию MTBGFP в клеточную суспензию THP1 и перемешать путем пипетирования вверх и вниз. Конечная плотность клеток THP1 составляет пять умножить на 10 с точностью до пятой на миллилитр, а соответствующая двойственность инфекции составляет 40.

Далее налейте суспензию THP1 MTBGFP в резервуар объемом 25 миллилитров, а затем с помощью многоканальной пипетки добавьте по 200 микролитров суспензии THP1 MTBGFP во все оставшиеся 96 лунок, от Е три до G 11. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2 в течение 7-10 дней. Каждые два дня на протяжении инкубации используйте многоканальную пипетку для смены среды, медленно удаляя 100 микролитров отработанной среды с верхней части каждой лунки и осторожно добавляя 100 микролитров предварительно подогретого RPMIC.

При смене среды важно следить за тем, чтобы не нарушить агрегаты макрофагов МТБ на дне скважин. Каждый день визуально осматривайте лунки с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного светлым полем и комплектами фильтров GFP с объективом от 4 до 10 раз. Обратите внимание на размер агрегатов макрофагов MTB и при необходимости захватите изображения.

К 7-10 деньм агрегаты макрофагов МББ должны стать достаточно большими, чтобы можно было приступить к тестированию эффективности препарата, как описано далее в видео. Для испытания лекарств приготовьте два противотуберкулезных препарата в трех экземплярах на новой 96-луночной пластине следующим образом. Сначала добавьте 125 микролитров среды 7H9C в лунки B со второй по G 10.

Затем приготовьте два препарата с удвоенной максимальной желаемой конечной концентрацией в одном миллилитре 7H9C. С помощью пипетки добавьте по 250 микролитров каждого препарата в лунки B, C и D 11, а затем E, F и G 11 соответственно для тройного лечения. Далее с помощью многоканальной пипетки последовательно разбавляют исследуемые препараты в два раза, перемещая 125 микролитров из B 11 через G 11 в B 10 через G 10.

Перемешивайте пипеткой пять раз на каждом этапе. Продолжайте перемещать 125 микролитров от столбца к столбцу справа налево по тарелке и остановитесь после четвертого столбца. После смешивания четыре колонны выбросьте 125 микролитров в контейнер для отходов.

Во второй и третьей колонках не должно быть никаких лекарственных препаратов. Это позволит использовать их как фон, так и для положительного контроля роста. Затем извлеките из инкубатора 96-луночный планшет, содержащий инфицированные МБТ макрофаги.

Не наклоняя планшет, с помощью многоканальной пипетки удалите 150 микролитров среды из лунок B two по G 11. Затем наклоните пластину, как показано здесь, и вставьте наконечники пипетки в нижний край лунок и удалите оставшуюся среду, около 50 микролитров. Поскольку агрегаты макрофагов MTB прилипают к дну скважины, материал не должен теряться.

Тем не менее, удаление среды должно быть как можно более щадящим, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать повторного суспендирования во время этого процесса. Аккуратно добавьте 100 микролитров среды 7H9C в лунки B со второй по G11 пластины, в которых содержатся агрегаты макрофагов MTB. С помощью многоканальной пипетки переносят 100 микролитров препарата, содержащего 96 лунок планшета, в соответствующие лунки инфицированной пластины.

Затем поместите тарелку в герметичный пакет и выдерживайте ее в течение трех дней при температуре 37 градусов Цельсия. Анализ на резазурин основан на окислительных веществах, продуцируемых метаболически активным горным велосипедом, для преобразования синего резазурина во флуоресцентный розовый резоруфин. Изменение цвета и флуоресценции может быть использовано в качестве суррогатного маркера для определения степени роста бактерий.

Приготовьте стоковый раствор резазурина в конечной концентрации 8 миллиграмм на миллилитр в воде. Фильтруйте через мембрану из ПВДФ размером пор 22 микрометра для стерилизации. Приготовьте рабочий раствор в резазурине, смешав исходный раствор, воду и Твин-80 в соотношении два к одному.

Конечные концентрации составляют 4 миллиграмма на миллилитр резазурина и 5% Tween-80. Используя планшетный считыватель, настройте программу для считывания флуоресценции при возбуждении 530 нанометров и излучении 590 нанометров в течение 24 часов каждые 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Предварительно прогрейте считыватель пластин до 37 градусов по Цельсию.

С помощью многоканальной пипетки добавьте 20 микролитров рабочего раствора резазурина в лунки В со второй по G 11 обработанной препаратом пластины. Поместите пластину на считыватель и запустите программу. Для подтверждения надежности адаптации данной модели инфекции к формату 96-луночного планшета была оценена чувствительность MTB рифампицина RIF к моксифлоксацину мокси, как описано в этом видео.

Как показано на рисунке, агрегатные структуры макрофагов MTB были успешно сгенерированы в формате 96-луночного планшета, что обеспечивает сквозную совместимость. Для количественного измерения конверсии резазурина в качестве индикатора роста бактерий флуоресценция отдельных лунок контролировалась кинетически в течение 24 часов. Наличие жизнеспособных клеток MTB определяется конверсией синего красителя резазурина в его розовую восстановленную форму, которая количественно отражается относительной флуоресценцией z сеток во время насыщения.

Эти репрезентативные мини-графики показывают результирующие единицы флуоресценции, отображаемые по оси Y, в зависимости от времени, отображаемого на оси X. Для создания кривых уничтожения чувствительности к препаратам рифампицин и моксифлоксацин в лунках, обработанных лунками, нормализовали до максимального роста МБТ без контроля лекарств как 100% выживаемость. Из каждой скважины образца вычитались пустые сигналы фонового контроля.

Процент выживаемости был построен для каждой отдельной концентрации лекарственного препарата для создания кривой убийства. Эти данные показывают, что минимальная ингибиторная концентрация определяет самую низкую концентрацию антибиотика, при которой наблюдается 90%-ное ингибирование роста, превышающую два микрограмма на миллилитр, как для рифампицина, так и для моксифлоксацина против МТБ, полученной из нашей модели инфекции. Таким образом, минимальная ингибиторная концентрация этих двух препаратов против МББ с использованием нашей модели инфекции и анализа в большей степени отражает активность этих препаратов in vivo.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как надежно и воспроизводимо генерировать агрегированные структуры макрофагов, инфицированных МББ, для тестирования на чувствительность к лекарственным препаратам с помощью анализа на резазурин. После этой процедуры легко выполнить модификацию шаблона лекарства из двух препаратов, как показано на панели библиотеки 58 лекарств, чтобы обеспечить скрининг наркотиков с высокой точностью.