Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши

Общая цель данной процедуры заключается в получении и количественной оценке разнообразного набора индуцированных подтипов кардиомиоцитов. Этот метод позволяет ответить на ключевые фундаментальные вопросы, касающиеся специфического для подтипа переключения линий при сердечном репрограммировании, такие как необходимые сигналы, регулирующие сборку саркомеров и спецификацию подтипа. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет количественно оценивать эффекты спецификации подтипов кардиомиоцитов, что необходимо для проведения исследований механизмов.

Для начала выделите эмбриональные фибробласты мыши из эмбрионов стадии E 12.5. Храните их в жидком азоте, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Затем снимите клетки plat-E и посейте их в шестилуночный планшет из расчета один миллион клеток на лунку, чтобы за 24 часа клетки достигли 70–80% конфлюэнтности.

Покройте клетки трансфекционной средой и инкубируйте их в стандартных условиях культивирования. За один день до проведения эксперимента возьмите коническую полистирольную пробирку объемом 15 мл и смешайте 60 µL среды с пониженным содержанием сыворотки с шестью µL реагента для трансфекции на одну реакцию. Инкубируйте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре.

Чтобы избежать снижения эффективности трансфекции, добавляйте реагент для трансфекции непосредственно в среду с пониженным содержанием сыворотки. Затем добавьте в каждую реакцию коктейль GHMT в общем количестве 2 µg и осторожно постучите по пробирке для перемешивания. Инкубируйте реакционную смесь в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего по каплям добавьте смесь к клеткам plat-E.

Запишите дату и время трансфекции. Инкубируйте трансфецированные клетки plat-E в течение ночи. За один час до высева эмбриональных фибробластов мыши подготовьте 24-луночный планшет для иммуноцитохимического анализа, поместив в каждую лунку покровные стекла диаметром 12 мм, покрытые фибронектином.

Затем добавьте по 300 µL раствора бычьего коллагена в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение одного часа. Ближе к концу инкубации разморозьте криопробирку с замороженными эмбриональными фибробластами мыши HCN4GFP. Быстро разморозьте клетки, один раз промойте их предварительно подогретой средой для фибробластов и определите концентрацию живых клеток.

Затем аспирируйте раствор для покрытия из 24-луночного планшета и немедленно высейте по 30 000 клеток на лунку на покровные стекла, покрытые коллагеном и фибронектином. Через 24 часа после трансфекции профильтруйте ретровирусную среду через фильтр из ацетата целлюлозы без сурфактанта с размером пор 0.45 micron и перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 milliliter. Затем добавьте полибрен до конечной концентрации 8 µg/mL.

Осторожно добавьте в cells plat-E два миллилитра свежей среды для трансфекции. Слишком быстрая замена среды может привести к откреплению клеток. Правильно культивируемые cells plat-E производят в среднем десять миллионов инфекционных единиц на миллилитр.

Высокий уровень экспрессии и интенсивность GFP в более чем 95% клеток обычно коррелируют с успешной генерацией индуцированных кардиомиоцитоподобных миоцитов с помощью GHNT. Затем аспирируйте среду из культур эмбриональных фибробластов и добавьте свежесобранную ретровирусную среду. После этого верните планшет в инкубатор и инкубируйте в течение ночи.

На следующий день снова перенесите среду от клеток plat-E к эмбриональным фибробластам. После второго сбора вируса клетки plat-E следует утилизировать. Через 48 часов после индукции аспирируйте кондиционированную среду и один раз промойте клетки раствором PBS.

Затем добавьте по 500 µL предварительно подогретой среды для индукции кардиомиоцитоподобных клеток в каждую лунку планшета на 24 лунки. Заменяйте среду каждые два-три дня в течение следующих 12 дней. Через 14 дней после индукции аккуратно аспирируйте среду и промойте каждую лунку 300 µL ледяного PBS.

Затем удалите PBS и добавьте в каждую лунку по 250 µL 4% раствора параформальдегида, после чего инкубируйте клетки в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее проведите пермеабилизацию клеток, промыв лунки трижды по пять минут 300 µL 0,1% Triton X-100 в PBS. После последнего промывания аспирируйте избыток раствора для пермеабилизации, а затем добавьте универсальный блокирующий буфер в объеме 300 µL на лунку.

Инкубируйте для блокировки в течение 10 минут при комнатной температуре. Окрашивайте одну пару предметных стекол в течение ночи с использованием антител мыши против альфа-актенина, куриных против GFP и кроличьих против NPPA для идентификации индуцированных миоцитов с pacemaker-подобными свойствами среди индуцированных предсердно-подобных миоцитов. На следующий день промойте лунки и добавьте соответствующую вторичную антителу, как описано в прилагаемом текстовом протоколе.

После дополнительных промывок нанесите 2,4 µL среды для заключения на предметное стекло микроскопа. Возьмите покровное стекло из 24-луночного планшета и удалите излишки раствора. Затем перенесите его на предметное стекло со средой для заключения.

Для каждого препарата начните с одного края и сканируйте образец вверх-вниз в красном флуоресцентном канале, чтобы идентифицировать клетки с положительным окрашиванием на альфа-актинин и саркомеры. Стриации саркомеров легче всего идентифицировать при длине волны 555 нанометров. После идентификации переключитесь на зеленый канал и отметьте, являются ли клетки положительными.

Затем переключитесь на компьютер, чтобы оценить длину волны дальнего красного спектра 647 нанометров для поиска окрашивания на NPPA или MYL2. Клетки, положительные по альфа-актинину и саркомерам, отрицательные по Hnc4-GFP и положительные по Nppa, представляют собой индуцированные предсердцеподобные миоциты. Окрашивание на Nppa будет выглядеть как пунктирное и локализовано вокруг ядра.

Сначала подсчитайте количество клеток через 24 часа после посева, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем визуально осмотрите каждую клетку на покровном стекле на предмет правильного окрашивания на alpha-actinin и саркомеры и запишите количество клеток, положительно окрашенных по обоим маркерам. После этого разделите полученное число на фактическое общее количество высеянных клеток.

В среднем в эксперименте по репрограммированию примерно один процент клеток оказываются положительными и по альфа-актинину, и по саркомерам. К 14-му дню эксперимент можно завершить и оценить организацию саркомеров. Она определяется по положительному окрашиванию на альфа-актинин, показанному здесь красным цветом.

Способность к спонтанному сокращению присуща только тем клеткам, которые обладают организацией саркомеров, поэтому данная проверка является оптимальным первым этапом. Здесь представлены индуцированные кардиомиоциты, подобные клеткам водителя ритма, от мышей-репортеров Hcn4-GFP. Три клетки в данном поле зрения демонстрируют организацию саркомеров.

В центре изображения присутствуют три клеточных кластера, положительных по Hcn4-GFP, которые можно идентифицировать как клетки водителя ритма. В нижней левой части наблюдается одна клетка с окрашиванием на альфа-актинин, но без организации саркомеров или идентифицируемого маркера подтипа. В этой популяции индуцированных желудочкоподобных кардиомиоцитов центральная клетка демонстрирует организацию саркомеров; эта клетка также дает положительное окрашивание на маркер легких цепей миозина MYL-2, который является маркером желудочковых кардиомиоцитов.

После освоения метода высев и трансфекция клеток plat-E могут быть выполнены за один час. Индукция эмбриональных фибробластов мыши занимает от одного до двух часов, а количественное определение миотобов в полном 24-луночном планшете — около восьми часов. При выполнении данной процедуры важно помнить, что здоровые эмбриональные фибробласты мыши и вирусы с высоким титром являются ключевыми факторами успешного эксперимента по репрограммированию.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как генерировать и количественно определять отдельные индуцированные подтипы кардиомиоцитов.