Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств
April 15th, 2017
Здесь мы покажем генерацию человеческой инженерии сердечной ткани от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) -derived кардиомиоцитов. Мы представляем метод анализа сжатия силы и примерное изменение сжатия рисунка с помощью ингибитора HERG канала E-4031. Этот метод показывает высокий уровень надежности и пригодности для сердечного скрининга лекарственных средств.
Общая цель этого метода заключается в создании трехмерной инженерной ткани сердца, которая может быть использована в качестве платформы для анализа сокращений in vitro для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кардиологии о моделировании заболеваний, фармакологии безопасности и влиянии вариантов генов или лекарств на сократительную силу. Основное преимущество этого метода заключается в том, что сократительная сила может быть измерена в сконструированных тканях сердца различных видов в стерильных условиях, в течение длительных периодов времени.
Ученые, новички в этом методе, могут бороться с недостаточным качеством клеток. Или недостаток в среде. Важно оптимизировать самоподготовку и избежать циклов демонстрации этой процедуры будет Аника Бензин и Умбер Салим.
Перед началом процедуры добавьте 1,6 миллилитра теплой двухпроцентной агарозы в лунки первой помощи 24-луночной пластины. И сразу же поместите политетрафторэтилен в прокладках в агарозу. Примерно через 10 минут при комнатной температуре агароза станет непрозрачной, что будет означать ее затвердевание.
Снимите распорки и поместите стойки PDMS в отливки так, чтобы пары стоек достигали каждой агарозной формы. Когда все стойки расставлены, мы суспендируем кардиомиоциты в среде в минимальной концентрации 1,5 умножить на 10 до 7 клеток на миллилитр и свежеприготовленную реконструкцию смешиваем с фибриногеном от 10 до 15 раз с помощью серологической пипетки до тех пор, пока фибриноген не растворится. Проверьте смесь для восстановления в пипетке на однородность.
Затем для каждой сконструированной сердечной ткани, или ЭГТ, смешайте 100 микролитров восстановительной смеси с тремя микролитрами тромбина в 200-литровой пробирке. И сразу же аликвотировать 100 микролитров этой ЭГТ тромбиновой смеси в агарозные щели. Используйте новый фильтрующий наконечник для каждого EHT.
После того, как все слоты будут заполнены смесью для восстановления, закройте крышку чашки для клеточных культур и инкубируйте препараты в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и семи процентах углекислого газа. По окончании инкубации поместите тарелку в стерильный колпак и накройте каждую лунку от 200 до 500 микролитров среды. Осторожно встряхните пластину и верните EHT в инкубатор.
Через 10 минут осторожно переложите штативы в новую 24-луночную пластину, содержащую 1,5 миллилитров среды EHT на лунку, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур в соответствующих условиях культивирования. Подача ЭГТ каждый понедельник, среду и пятницу путем переноса штативов PDMS на вторую тарелку со свежей средой. Через 7-10 дней после литья ЭГТ должны продемонстрировать спонтанные сокращения, отклоняющие стойки стоек PDMS.
Чтобы проанализировать сокращения ЭГТ, в день эксперимента включите нагревательное устройство в приборе для анализа ЭГТ за два часа до измерения. Непосредственно перед анализом включите газовую и электронную подачу осевой системы. Для базовой записи поместите пластину EHT в прибор для анализа EHT и запустите программное обеспечение для анализа сокращений в соответствии с инструкциями производителя.
Используя инструкции руководства по программному обеспечению для запуска нового прогона, перейдите на вкладку протокола, чтобы ввести соответствующую информацию об исследовании. Откройте вкладку «Настройка» и выберите скважины для анализа. Из-за нехватки времени в этом видео это демонстрируется только для двух EHT.
Затем перейдите на вкладку просмотра камеры и запустите режим камеры в реальном времени с автоматическим режимом определения фигур. Отрегулируйте положение камеры с помощью координат xyz для каждой выбранной лунки в чашке с 24 лунками, следя за тем, чтобы каждая EHT находилась в центре окна и в фокусе. Убедитесь, что синие крестики находятся на верхнем и нижнем концах EHT и перемещаются в соответствии с сокращениями EHT.
И нажмите кнопку position okay, чтобы сохранить заданные позиции каждой скважины. Теперь перейдите на вкладку параметров, чтобы определить критерии, по которым программное обеспечение идентифицирует пик сокращения, отметив пики зелеными квадратами. Сохраните все введенные настройки, нажав кнопку использовать параметры на всех скважинах.
Затем нажмите на вкладку «Автоматически» и кнопку «Пуск», чтобы записать исходные сокращения EHT и рассчитать спонтанную базовую сократимость для каждой EHT. Анализ сокращения в реальном времени будет отображаться во вкладке в режиме реального времени. Убедитесь, что синие крестики движутся только вертикально, чтобы соответствовать сокращениям EHT.
Чтобы проанализировать влияние конкретного препарата, представляющего интерес, на схватки, сначала перенесите 24-луночный планшет, заполненный раствором щитовидной железы без белка, под стерильный колпак и поместите угольные электроды в лунки. Перенесите EHT в штативы PDMS поверх электродов и верните EHT в инкубатор. Примерно через полчаса поместите ЭГТ в блокировку прибора для анализа ЭГТ и зарегистрируйте спонтанную базовую сократимость в течение 20 секунд для каждой ЭГТ.
Затем подключите угольные электроды к кабелю электростимуляции и начните электрическую стимуляцию EHT. Записывайте базовый темп в течение 10 секунд для каждой EHT, следя за тем, чтобы все EHT были в правильном темпе. Сигнал о стимуляции теперь отмечен синими вертикальными линиями, включенными в сократительный трансплантат перед каждым пиком.
После базовой регистрации перенесите электроды и штативы PDMS на новую 24-луночную пластину, содержащую первую концентрацию препарата, и немедленно верните EHT в блокировку аналитического прибора EHT для 20-минутной инкубации. Подсоедините кабели электростимуляции, отрегулируйте распознавание фигур и запишите сокращения EHT в ответ на первую концентрацию препарата. После того, как все концентрации препарата будут протестированы, сохраните все полученные записи в формате PDF и проверьте каждую запись на предмет распознавания фигур и правильного расположения квадратов и артефактов пиков сокращения.
Для автономного анализа нажмите кнопку Выбрать прогон для соответствующего прогона из базы данных прогонов и на вкладке параметров измените параметр для анализа сокращений. Затем на вкладке «Офлайн» выберите «Автономный анализ», чтобы повторно проанализировать видео. Настроить распознавание фигуры и записать новый видеофайл.
Настройте распознавание фигур на вкладке реального времени и выберите просмотр образца. Теперь EHT будет анализироваться в соответствии с новыми позициями. Анализ каждой ЭГТ основан на распознавании фигуры на верхнем и нижнем концах ткани.
Затем записанные на пленку сокращения EHT автоматически анализируются программным алгоритмом прибора для анализа EHT, а пики определяются в соответствии с соответствующими заранее определенными критериями. Долгосрочное измерение анализа сокращений EHT показывает, что нет никаких видимых зависящих от времени изменений силы сокращения, частоты сокращения, сокращения Т1 или времени расслабления Т2 в течение 20 часов. Что указывает на высокий уровень устойчивости конструкций.
Действительно, результаты для каждого сигнального EHT могут быть воспроизведены с низкой вариабельностью. Воздействие блокатора каналов hERG, однако, приводит к значительному увеличению времени релаксации Т2, начиная с концентрации. И нерегулярный характер взбивания при более высоких концентрациях.
После освоения 24 EHT могут быть сгенерированы в течение 30 минут, если подготовка выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области моделирования заболеваний для изучения влияния вариантов генов in vitro. Универсальность этой модели, позволяет сочетать ее с индуцированными стволовыми клетками человека или технологией редактирования генома.
После этой процедуры можно использовать дополнительные методы, такие как гистология или анализ РНК и белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы о транскрипции и экспрессии генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как забрасывать и анализировать EHT. Если у вас есть какие-либо вопросы относительно этой процедуры, пожалуйста, не стесняйтесь и свяжитесь с нами напрямую.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование демонстрирует генерацию трехмерной инженерной сердечной ткани из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) для анализа сокращения in vitro. Метод позволяет оценить силу сокращения и влияние фармакологических агентов, таких как ингибитор канала hERG E-4031, на паттерны сокращения.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Инженерия сердечной ткани
- Фармакология
- Исследование стволовых клеток
Бакграунд
- Инженерные сердечные ткани могут моделировать сердечно-сосудистые заболевания.
- In vitro платформы необходимы для скрининга лекарств и фармакологии безопасности.
- Понимание контрактильной силы важно для оценки сердечной функции.
- К проблемам относятся поддержание качества клеток и оптимизация условий культивирования.
Цель исследования
- Разработать надежный метод для генерации инженерной сердечной ткани.
- Анализировать влияние лекарств на сердечные сокращения.
- Предоставить платформу для изучения генных вариантов и их влияния на функцию сердца.
Использованные методы
- Генерация инженерной сердечной ткани из кардиомиоцитов, полученных из hiPSC.
- Измерение силы сокращения в стерильных условиях.
- Оценка паттернов сокращения в ответ на фармакологические агенты.
- Оптимизация условий культивирования для качества клеток.
Основные результаты
- Успешная генерация функциональной инженерной сердечной ткани.
- Демонстрируется изменение паттернов сокращения с использованием E-4031.
- Надежность метода подтверждает его использование в скрининге лекарств.
- Потенциал для долгосрочных исследований сердечной функции.
Выводы
- Метод предоставляет ценный инструмент для исследования сердца.
- Он позволяет изучать эффекты лекарств на сердечную ткань in vitro.
- Будущие применения включают моделирование заболеваний и фармакологию безопасности.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated contraction analysis of human engineered heart tissue provides a scalable, standardized platform for early cardiac drug safety screening, enabling quantitative assessment of contractile force and drug-induced arrhythmia risk. This approach supports mechanistic de-risking by replicating human cardiac responses to pharmacological agents like hERG inhibitors, improving target validation confidence. The method enhances predictive value in lead identification by bridging stem cell-derived models with functional readouts relevant to clinical safety outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through force-generating human heart tissue models that reflect disease-relevant contractile physiology.
- Operational Value: Supports biological de-risking by detecting drug effects on contraction kinetics and relaxation times in a human-derived system.
- Predictive Value: Generates quantitative data on T2 prolongation and beating irregularity to prioritize targets with improved cardiac safety profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, sterile 3D tissues in 24-well format compatible with automated imaging and contraction analysis workflows.
- Quantitative Output: Measures shortening-based force via PDMS post deflection, enabling dose-response assessment of compounds like E-4031.
- Scalability: Allows generation of several hundred engineered heart tissues per week, limited only by cardiomyocyte availability, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human cardiomyocytes to model contraction dynamics, improving translational alignment with human cardiac function.
- Mechanistic Continuity: Captures auxotonic contractions and relaxation parameters that reflect electromechanical coupling, supporting preclinical risk assessment.
- Decision Support: Enables replication of drug-induced contractile changes, informing go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, providing functional validation of molecular targets in a human tissue context.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on gene variants and drug effects by measuring real-time contractile force in engineered human heart tissue.
- Screening: Delivers reproducible, automated contraction readouts that support assay standardization and compound screening under controlled conditions.
- Analytics: Generates quantifiable parameters including contraction amplitude, beating frequency, and T2 relaxation time for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Uses human-derived tissues to bridge in vitro findings with clinical safety expectations, particularly for ion channel liabilities.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety screening that can be applied across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac drug response.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through automated figure recognition and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic compounds early, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative safety signals derived from human heart tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac tissue engineering, sterile cell culture, and cardiomyocyte handling.
- Depends on imaging hardware with XYZ axis control and automated figure recognition software for contraction detection.
- Necessitates cross-team standardization of tissue generation, drug exposure, and analysis protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to different cell sources or genetic models while maintaining tissue integrity and function.
- Limited by cardiomyocyte availability and maturation state, which affects contractile performance and assay consistency.
