Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств

Общая цель этого метода заключается в создании трехмерной инженерной ткани сердца, которая может быть использована в качестве платформы для анализа сокращений in vitro для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кардиологии о моделировании заболеваний, фармакологии безопасности и влиянии вариантов генов или лекарств на сократительную силу. Основное преимущество этого метода заключается в том, что сократительная сила может быть измерена в сконструированных тканях сердца различных видов в стерильных условиях, в течение длительных периодов времени.

Ученые, новички в этом методе, могут бороться с недостаточным качеством клеток. Или недостаток в среде. Важно оптимизировать самоподготовку и избежать циклов демонстрации этой процедуры будет Аника Бензин и Умбер Салим.

Перед началом процедуры добавьте 1,6 миллилитра теплой двухпроцентной агарозы в лунки первой помощи 24-луночной пластины. И сразу же поместите политетрафторэтилен в прокладках в агарозу. Примерно через 10 минут при комнатной температуре агароза станет непрозрачной, что будет означать ее затвердевание.

Снимите распорки и поместите стойки PDMS в отливки так, чтобы пары стоек достигали каждой агарозной формы. Когда все стойки расставлены, мы суспендируем кардиомиоциты в среде в минимальной концентрации 1,5 умножить на 10 до 7 клеток на миллилитр и свежеприготовленную реконструкцию смешиваем с фибриногеном от 10 до 15 раз с помощью серологической пипетки до тех пор, пока фибриноген не растворится. Проверьте смесь для восстановления в пипетке на однородность.

Затем для каждой сконструированной сердечной ткани, или ЭГТ, смешайте 100 микролитров восстановительной смеси с тремя микролитрами тромбина в 200-литровой пробирке. И сразу же аликвотировать 100 микролитров этой ЭГТ тромбиновой смеси в агарозные щели. Используйте новый фильтрующий наконечник для каждого EHT.

После того, как все слоты будут заполнены смесью для восстановления, закройте крышку чашки для клеточных культур и инкубируйте препараты в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и семи процентах углекислого газа. По окончании инкубации поместите тарелку в стерильный колпак и накройте каждую лунку от 200 до 500 микролитров среды. Осторожно встряхните пластину и верните EHT в инкубатор.

Через 10 минут осторожно переложите штативы в новую 24-луночную пластину, содержащую 1,5 миллилитров среды EHT на лунку, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур в соответствующих условиях культивирования. Подача ЭГТ каждый понедельник, среду и пятницу путем переноса штативов PDMS на вторую тарелку со свежей средой. Через 7-10 дней после литья ЭГТ должны продемонстрировать спонтанные сокращения, отклоняющие стойки стоек PDMS.

Чтобы проанализировать сокращения ЭГТ, в день эксперимента включите нагревательное устройство в приборе для анализа ЭГТ за два часа до измерения. Непосредственно перед анализом включите газовую и электронную подачу осевой системы. Для базовой записи поместите пластину EHT в прибор для анализа EHT и запустите программное обеспечение для анализа сокращений в соответствии с инструкциями производителя.

Используя инструкции руководства по программному обеспечению для запуска нового прогона, перейдите на вкладку протокола, чтобы ввести соответствующую информацию об исследовании. Откройте вкладку «Настройка» и выберите скважины для анализа. Из-за нехватки времени в этом видео это демонстрируется только для двух EHT.

Затем перейдите на вкладку просмотра камеры и запустите режим камеры в реальном времени с автоматическим режимом определения фигур. Отрегулируйте положение камеры с помощью координат xyz для каждой выбранной лунки в чашке с 24 лунками, следя за тем, чтобы каждая EHT находилась в центре окна и в фокусе. Убедитесь, что синие крестики находятся на верхнем и нижнем концах EHT и перемещаются в соответствии с сокращениями EHT.

И нажмите кнопку position okay, чтобы сохранить заданные позиции каждой скважины. Теперь перейдите на вкладку параметров, чтобы определить критерии, по которым программное обеспечение идентифицирует пик сокращения, отметив пики зелеными квадратами. Сохраните все введенные настройки, нажав кнопку использовать параметры на всех скважинах.

Затем нажмите на вкладку «Автоматически» и кнопку «Пуск», чтобы записать исходные сокращения EHT и рассчитать спонтанную базовую сократимость для каждой EHT. Анализ сокращения в реальном времени будет отображаться во вкладке в режиме реального времени. Убедитесь, что синие крестики движутся только вертикально, чтобы соответствовать сокращениям EHT.

Чтобы проанализировать влияние конкретного препарата, представляющего интерес, на схватки, сначала перенесите 24-луночный планшет, заполненный раствором щитовидной железы без белка, под стерильный колпак и поместите угольные электроды в лунки. Перенесите EHT в штативы PDMS поверх электродов и верните EHT в инкубатор. Примерно через полчаса поместите ЭГТ в блокировку прибора для анализа ЭГТ и зарегистрируйте спонтанную базовую сократимость в течение 20 секунд для каждой ЭГТ.

Затем подключите угольные электроды к кабелю электростимуляции и начните электрическую стимуляцию EHT. Записывайте базовый темп в течение 10 секунд для каждой EHT, следя за тем, чтобы все EHT были в правильном темпе. Сигнал о стимуляции теперь отмечен синими вертикальными линиями, включенными в сократительный трансплантат перед каждым пиком.

После базовой регистрации перенесите электроды и штативы PDMS на новую 24-луночную пластину, содержащую первую концентрацию препарата, и немедленно верните EHT в блокировку аналитического прибора EHT для 20-минутной инкубации. Подсоедините кабели электростимуляции, отрегулируйте распознавание фигур и запишите сокращения EHT в ответ на первую концентрацию препарата. После того, как все концентрации препарата будут протестированы, сохраните все полученные записи в формате PDF и проверьте каждую запись на предмет распознавания фигур и правильного расположения квадратов и артефактов пиков сокращения.

Для автономного анализа нажмите кнопку Выбрать прогон для соответствующего прогона из базы данных прогонов и на вкладке параметров измените параметр для анализа сокращений. Затем на вкладке «Офлайн» выберите «Автономный анализ», чтобы повторно проанализировать видео. Настроить распознавание фигуры и записать новый видеофайл.

Настройте распознавание фигур на вкладке реального времени и выберите просмотр образца. Теперь EHT будет анализироваться в соответствии с новыми позициями. Анализ каждой ЭГТ основан на распознавании фигуры на верхнем и нижнем концах ткани.

Затем записанные на пленку сокращения EHT автоматически анализируются программным алгоритмом прибора для анализа EHT, а пики определяются в соответствии с соответствующими заранее определенными критериями. Долгосрочное измерение анализа сокращений EHT показывает, что нет никаких видимых зависящих от времени изменений силы сокращения, частоты сокращения, сокращения Т1 или времени расслабления Т2 в течение 20 часов. Что указывает на высокий уровень устойчивости конструкций.

Действительно, результаты для каждого сигнального EHT могут быть воспроизведены с низкой вариабельностью. Воздействие блокатора каналов hERG, однако, приводит к значительному увеличению времени релаксации Т2, начиная с концентрации. И нерегулярный характер взбивания при более высоких концентрациях.

После освоения 24 EHT могут быть сгенерированы в течение 30 минут, если подготовка выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области моделирования заболеваний для изучения влияния вариантов генов in vitro. Универсальность этой модели, позволяет сочетать ее с индуцированными стволовыми клетками человека или технологией редактирования генома.

После этой процедуры можно использовать дополнительные методы, такие как гистология или анализ РНК и белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы о транскрипции и экспрессии генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как забрасывать и анализировать EHT. Если у вас есть какие-либо вопросы относительно этой процедуры, пожалуйста, не стесняйтесь и свяжитесь с нами напрямую.