Точность резки Мышь легких Кусочки визуализировать в прямом легочная дендритные клетки

Общая цель данного метода заключается в использовании прецизионно разрезанных срезов легкого (PCLS) для визуализации локализации и трафика различных типов иммунных клеток в легких. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как характер локализации и миграции иммунных клеток в легких. Основным преимуществом данной методики является возможность визуализации нескольких типов взаимодействий в живой ткани ex vivo, в которой сохраняется трехмерная архитектура легкого.

Хотя данный метод позволяет получить представление о локализации и перемещении иммунных клеток при воспалении, его также можно использовать для визуализации сокращения тканей дыхательных путей и гладких мышц. Чтобы извлечь легочную ткань, сначала с помощью ножниц рассеките кожу и брюшину от середины живота до нижней челюсти мыши в возрасте от 6 до 12 недель и отодвиньте кишечник в сторону от брюшной полости. Перережьте нижнюю полую вену, чтобы вывести кровь из легких, и острым концом ножниц проколите диафрагму, чтобы обеспечить расширение грудной клетки.

Затем с помощью пинцета осторожно отодвиньте слюнные железы и другие ткани от трахеи, и с помощью тонкого пинцета сделайте надрез в трахее с передней стороны самого толстого хрящевого кольца, достаточного для проникновения иглы калибра 20 gauge. Теперь наденьте иглу калибра 20 gauge длиной 1,5 дюйма на отрезок полиэтиленовой трубки и обрежьте трубку под углом примерно 45 градусов. Присоедините иглу к шприцу объемом 1 мл и наберите в шприц 0,8 мл 2% низкоплавящего агарозы, подогретой до 40 °C.

После того как весь агарозный гель будет загружен, вставьте скошенный конец трубки в разрез и медленно введите агарозу в легкие. Не перемещая иглу или шприц, прикрепите шприц к полистирольному основанию с помощью ленты, чтобы зафиксировать иглу в трахее, и поместите животное в камеру для хранения при температуре 4 °C минимум на 10 минут. После затвердевания агарозы осторожно вырежьте легкие с помощью ножниц и поместите их в чашку диаметром 3 см с ледяным раствором PBS.

Затем поверните долю для нарезания ткани так, чтобы внутренняя часть легкого, соединяющаяся с трахеей, была обращена вниз. Для нарезания ткани легкого сначала нанесите небольшую каплю универсального нетекучего суперклея-геля All Purpose No Run gel на металлический поршень шприца, распределяя клей круговыми движениями. После нанесения всего объема клея с помощью пинцета немедленно, но осторожно захватите иссеченную долю стороной трахеи вниз и промокните ее салфеткой, чтобы удалить излишки жидкости.

Осторожно поместите высушенную долю легкого на поршень и обрежьте излишки ткани, выходящие за края поршня. Опустите поршень так, чтобы стенки металлического шприца поднялись и охватили ткань, создавая лунку с легким на дне ствола шприца глубиной не более нескольких сантиметров. Закрепите нижнюю часть шприца лентой, чтобы зафиксировать поршень на месте.

Затем осторожно залейте в шприц 2% низкоплавящий агарозу с температурой 40 °C так, чтобы она едва покрывала верхнюю часть доли, и поместите металлический шприц в охлаждающий блок с ледяной водой. Через одну-две минуты установите шприц с образцом в автоматический слайсер и выровняйте новое лезвие. Затем наполните резервуар для буфера ледяным PBS.

Совместите привод шагового двигателя со шприцем с образцом и удалите ленту. Переключите рычаг в положение быстрой перемотки вперед, пока привод шагового двигателя не коснется задней части поршня. Установите толщину ткани, режим непрерывного послойного среза, осцилляцию и скорость на слайсере.

Затем нажмите кнопку запуска и с помощью тонкого шпателя собирайте каждый срез PCLS по мере их попадания в резервуар с буфером, помещая срезы в отдельные лунки 24-луночного планшета, содержащего ледяной PBS. Для статической визуализации PCLS перенесите образцы легких, содержащие интересующую анатомическую область, в отдельные чашки диаметром три сантиметра, содержащие один миллилитр соответствующего коктейля антител. После 30–60 минут выдержки на льду при перемешивании (роккировании) в защищенном от света месте промойте срезы дважды одним миллилитром ледяного PBS.

Затем добавьте по 50 µL PBS в новую круглую стеклянную чашку с плоским дном диаметром 3 см для каждого образца и быстро перенесите срезы в каждую каплю, осторожно расправляя кусочки ткани. После этого аспирируйте PBS с помощью пипетки, нанесите на предметное стекло каплю смолы для заключения при комнатной температуре и накройте стеклянным покровным стеклом. Для получения изображений ткани поместите чашку на предметный столик конфокального микроскопа под объективом 20x и используйте инструмент создания мозаики (tile tool), чтобы найти и отметить края ткани в режиме выпуклой оболочки (convex hull) для сокращения времени сканирования мозаики.

Затем установите диапазон z-стека, убедившись, что заданные диапазоны подходят для нескольких областей среза, особенно вдоль краев. Для визуализации живых клеток после 30 минут инкубации в соответствующем коктейле антител дважды промойте срезы одним миллилитром холодного Leibovitz 10. Затем добавьте 50 µL свежего Leibovitz 10 в одну лунку камерного покровного стекла для каждого образца, после чего немедленно перенесите каждый PCLS в среду, осторожно манипулируя тканями до их полного распластывания.

Затем с помощью пипетки аспирируйте среду из каждой камеры и зафиксируйте каждый PCLS платиновым грузиком. Осторожно нанесите пипеткой свежеприготовленный ледяной внеклеточный матрикс на каждый PCLS, следя за тем, чтобы гель располагался поверх срезов легкого и чтобы срезы не всплывали над гелем. Через пять минут при 37 °C перенесите предметное стекло в предварительно прогретую камеру конфокального микроскопа, установленную на 37 °C, под объектив 20x.

Затем установите диапазоны z-стека и тайлов в зависимости от желаемого интервала между кадрами, используя инструмент тайлирования для обозначения области интереса в ткани и настройку центрированной сетки для центрирования образца в поле зрения. Конвенциональные дендритные клетки с высоким уровнем экспрессии CD11b локализуются в паренхиме легких, тогда как CD103-положительные конвенциональные дендритные клетки располагаются преимущественно вокруг дыхательных путей и в субплевральной области. Совместное окрашивание на CD88 и CD172a позволяет отличить CD172a-отрицательные CD88-положительные альвеолярные макрофаги от CD172a-положительных CD88-положительных интерстициальных макрофагов, последние из которых преимущественно локализуются в паренхиме, а не в субэпителиальной области.

Совместное мечение CD90.2, известного маркера Т-клеток, и флуоресцентного белка TdTomato, трансгена, находящегося под транскрипционным контролем главного фактора транскрипции, необходимого для лимфангиогенеза, облегчает идентификацию лимфатических структур в легком. CD103-положительные конвенциональные дендритные клетки обнаруживаются в нескольких анатомических областях, включая экспрессирующий CD324 эпителий дыхательных путей, лимфатические сосуды и субплевральную область. Перемещение клеток и межклеточные взаимодействия могут быть зарегистрированы с помощью прижизненной визуализации клеток, как было продемонстрировано выше.

Например, в репрезентативном эксперименте через 16 часов после перорального введения ova-LPS можно четко наблюдать взаимодействие CD103-положительных дендритных клеток с адаптивно перенесенными ova-специфическими T-клетками в течение четырехчасового периода. При должном навыке подготовка ткани и техники срезания могут быть завершены за два с половиной часа при условии правильного выполнения. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости качественного раздувания легких агарозой и последующем поддержании максимально плоского положения хрупких срезов легких для проведения визуализации.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как воздействие на PCLS ацетилхолином или метахолином, чтобы ответить на дополнительные вопросы о кальциевой сигнализации и сократимости дыхательных путей при различных патологических состояниях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получать прецизионные срезы легких для визуализации локализации, трафика и взаимодействий иммунных клеток в легких.