Используя pHluorin-маркированные Рецепторы для мониторинга субклеточных локализации и торговли

Общая цель этого метода флуоресцентной визуализации заключается в мониторинге изменений в мембранном транспорте белка и внутриклеточном распределении. Этот метод позволяет получить представление об изменениях в транспорте белка, таких как влияние генетических мутаций или фармакологических агентов на скорость доставки везикул и экспрессию белка на поверхности клетки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что измерения можно проводить быстро, с высоким разрешением, в режиме реального времени, не разрушая образец.

За 48 часов до визуализации клетки нейробластомы 2А мыши трансфицируют плазмидной конструкцией, содержащей SEP, чувствительный к pH флуорофор, встраиваемый во внеклеточную область интересующего белка. Когда трансфицированные клетки будут готовы к визуализации, с помощью флуоресценции полного внутреннего отражения или микроскопии TIRF, добавьте к клеткам два миллилитра внеклеточного раствора pH 7,4 или ECS. Поместите тарелку с клетками на сцену для трансляции и используйте крепления для сцены, чтобы закрепить тарелку на месте.