Применение Генетически кодируемые Флуоресцентные окиси азота (NO •) зондов geNOps, в режиме реального времени изображений NO • Сигналы в одиночных камерах

Общая цель этого подхода к визуализации заключается в мониторинге сигналов оксида азота в режиме реального времени на уровне отдельных клеток с использованием нового класса генетически кодируемых флуоресцентных зондов оксида азота, geNOps. Учитывая важность оксида азота в биологии и физиологии, визуализация этой молекулы на клеточном или даже субклеточном уровне была желательна с момента ее открытия. Мы визуализируем сигналы оксида азота с помощью новых, довольно простых в конструкции зондов на основе флуоресцентных белков, geNOps.

ГеNOps реагируют непосредственно и немедленно на оксид азота путем гашения флуоресценции. Это означает, что вы можете в режиме реального времени отслеживать кинетику генерации, диффузии и деградации оксида азота в отдельных клетках. Основное преимущество geNOps заключается в том, что вы можете смотреть на сигналы оксида азота с высоким пространственным и временным разрешением с помощью обычного флуоресцентного микроскопа.

Начните эту процедуру с замены буфера для хранения эндотелиальной клеточной линии или клеток HEK293 на один миллилитр на лунку раствора бустера железа (II) при комнатной температуре. Высиживайте клетки ровно 20 минут в темноте. Процедура загрузки железа имеет важное значение для получения полной чувствительности зондов и может быть адаптирована для различных типов ячеек и областей применения.

После этого промойте клетки одним разом буфером для хранения и инкубируйте каждую лунку с двумя миллилитрами буфера для хранения в течение не менее двух часов при комнатной температуре, чтобы позволить клеткам сбалансироваться. Затем замените буфер для хранения на 3,3-микромоляр Фура-2АМ в одном миллилитре буфера для хранения. Защищайте клетки от света, и инкубируйте их в течение 45 минут.

Через 45 минут дважды промойте клетки буфером для хранения и еще раз инкубируйте их не менее 30 минут, чтобы дать клеткам возможность сбалансироваться. Чтобы начать процедуру, сначала зафиксируйте 30-миллиметровый покровный стекло, покрытый линией эндотелиальных клеток или клетками HEK293, в металлической перфузионной камере. Включите систему визуализации, а затем поместите металлическую перфузионную камеру на микроскоп.

Подсоедините приточную трубку к буферным резервуарам, а затем включите систему перфузии. Теперь подключите отток к вакуумному насосу, обеспечив равномерный поток и предотвратив слив покровного стекла. Запустите перфузию под действием силы тяжести с физиологическим буфером кальция с помощью полуавтоматической системы перфузии.

Затем определите настройки изображения с помощью соответствующего программного обеспечения. Выберите длины волн возбуждения 340 нм и 380 нм для визуализации Fura-2 и 480 нм для возбуждения G-geNOp. Далее выберите область визуализации, перемещая xyz-таблицу микроскопа до тех пор, пока несколько флуоресцентных клеток не окажутся в фокусе.

Затем определите области интереса. Нарисуйте области, охватывающие несколько целых одиночных флуоресцентных ячеек для каждого поля изображения. После этого определите фоновую область аналогичного размера.

Начните собирать данные на инвертированном и усовершенствованном флуоресцентном микроскопе с моторизованным предметным столиком и монохроматическим источником света. В качестве альтернативы можно возбуждать клетки на частотах 340 нм и 380 нм для Fura-2AM и 480 нм для G-geNOp соответственно. Установите соответствующее время экспозиции таким образом, чтобы четкий флуоресцентный сигнал мог обнаруживаться во времени для всех каналов.

Соберите излучаемый свет на 510 нм для Fura-2AM, 520 нм для G-geNOp с помощью ПЗС-камеры с соответствующим набором фильтров, состоящим из 500-нанометрового возбудителя, 495-нанометрового дихроичного и 510-520-нанометрового излучателя. Затем записывайте по одному общему кадру каждые три секунды. Запишите первые три минуты в физиологический буфер кальция, чтобы получить исходный уровень соответствующих сигналов флуоресценции.

Как только будет наблюдаться стабильная базовая флуоресценция, переключитесь на 100-микромолярный гистамин или АТФ, содержащий физиологический буфер кальция, чтобы стимулировать клетки в течение трех минут. Затем переключитесь обратно на физиологический кальциевый буфер без гистамина или АТФ и L-ННК на пять минут, чтобы удалить соединения из клеток. После этого введите 10-микромолярный NOC-7 в физиологический кальциевый буфер в течение двух минут с помощью перфузионной системы.

Донор оксида азота сильно влияет на флуоресценцию G-geNOp и обычно уменьшает количество клеток более чем на 20% в ответ на 10-микромолярный NOC-7. В клетках EA.hy926 эффект NOC-7 сильнее по сравнению с индуцированным агонистами гашением флуоресценции G-geNOp. После этого промойте соединение, высвобождающее оксид азота, в течение примерно 10 минут с физиологическим кальциевым буфером и прекратите запись, как только базальная флуоресценция восстановится.

Здесь представлены репрезентативные широкопольные флуоресцентные изображения клеток EA.hy926, экспрессирующих G-geNOp, которые загружены Fura-2AM. А вот репрезентативный временной ход одновременных регистраций сигналов Fura-2 и G-geNOp в ответ на 100-микромолярный гистамин. Как и указывалось, гистамин был удален через три минуты с помощью перфузионной системы.

Эти кривые представляют собой одновременные регистрации цитозольных сигналов кальция и оксида азота одной эндотелиальной клетки, загруженной Fura-2AM, временно экспрессирующей G-geNOp. Клетки стимулировали 100-микромолярным гистамином в течение трех минут в буфере, содержащем кальций. Здесь показаны репрезентативные одновременно зарегистрированные сигналы кальция и оксида азота в течение определенного времени в клетке EA.hy926, которая была предварительно обработана 500-микромолярной L-NNA перед измерением.

Клетки обрабатывали 100-микромолярным гистамином в присутствии двухмиллимолярного кальция. На этом рисунке показаны средние кривые, представляющие цитозольные сигналы оксида азота в ответ на одномикромолярную АТФ с последующей стимуляцией второй клетки 100-микромолярной АТФ. После освоения эта техника позволяет визуализировать сигналы оксида азота в режиме реального времени с минимальными усилиями.

Я считаю, что этот метод проложит путь для исследователей к изучению и повторному исследованию сигналов оксида азота в различных моделях клеток. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как использовать технологию geNOps для визуализации оксида азота в режиме реального времени в вашей модельной системе.