В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

Общая цель этих процедур состоит в том, чтобы изучить, как изменения в экспрессии генов, как в развивающихся клетках, так и в окружающей их среде, влияют на временные процессы во время развития. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, например, контролируется ли время определения судьбы генами, экспрессирующимися в клетке автономно внутри клетки, или клеткой неавтономно в соседних клетках. Основное преимущество этого метода заключается в возможности следить за отдельными клетками-предшественниками у позвоночных in vivo, поскольку клетки развиваются в генетически отличной среде.

Демонстрировать процедуру будет Стефани Дудчиг, научный сотрудник моей лаборатории. После подготовки эмбрионов рыбок данио, а также микроинъекций игл с Morpholinos, или мРНК, согласно текстовому протоколу, погрузите кончик иглы в каплю минерального масла в посуду. Измерьте объем впрыска, нажав ножную педаль, и отрегулируйте давление газа и/или время продолжительности впрыска до тех пор, пока объем впрыска не станет эквивалентным одному нанолитру, измеренному с помощью предметного стекла микрометра или градусной сетки окуляра.

Поместите предметное стекло микроскопа в чашку Петри и с помощью трансферной пипетки поместите эмбрионы одноклеточной стадии вдоль края предметного стекла. Далее с помощью пипетки для тонкого переноса удалите как можно больше жидкости, чтобы предотвратить движения во время инъекций. Затем с помощью наконечника пипетки Microloader с отрезанной половиной тонкого кончика выровняйте эмбрионы в одну колонну.

Затем опустите иглу в сторону одноклеточной стадии эмбриона и проникните хорион и желток одним плавным движением. Как только кончик иглы окажется в центре желтка, нажмите на ножную педаль один раз и введите один нанолитр мРНК H2AGFP или H2BRFP в желток одноступенчатого эмбриона. Извлеките иглу для инъекций, переместите чашку с эмбрионами, чтобы ввести следующий эмбрион в нужное положение, и продолжайте вводить до тех пор, пока не будет введена вся колонка эмбрионов.

После введения всех эмбрионов наклоните чашку под углом от 30 до 45 градусов и используйте мягкую струю среды E3 в выжимной бутылке, чтобы перенести введенные эмбрионы в новую, чистую чашку Петри. Через три часа после оплодотворения, под флуоресцентным микроскопом с увеличением от 2 до 5 раз, используйте фильтр RFP для проверки донорских эмбрионов на сигнал мечения. Отбирайте хорошо развитые эмбрионы с сильным флуоресцентным сигналом.

После подготовки инъекционных пластин и чашек Петри в соответствии с текстовым протоколом, отрежьте кончик пипетки Пастера из длинного стекла с тонко вытянутым стеклянным наконечником до длины, позволяющей комфортно маневрировать, с помощью алмазного ножа царапает иглу, вращая ее до тех пор, пока кончик не отпадет. Убедитесь, что срез прямой. Затем, чтобы не повредить дехорионированные эмбрионы, отполируйте стеклянную пипетку для переноса огнем, вращая поверхность разреза в горелке Бунзена для получения гладких концов.

Чтобы дехорионировать эмбрионы, поместите хорошо развитые эмбрионы хозяина и донора в два отдельных стеклянных стакана Эрленмейера объемом 10 миллилитров и удалите как можно больше жидкости. Добавьте в каждый стакан по 5 миллилитров приготовленного ранее раствора протеазы 0,5 миллиграмм на миллилитр, и аккуратно взбалтывайте зародыши, рассматривая их под препарирующим микроскопом. Продолжая вращаться, как только первый эмбрион выйдет из хориона, используйте среду E3 для выполнения трех быстрых полосканий, чтобы удалить раствор протеазы, вылив большую часть жидкости, и снова наполните стакан, осторожно вливая E3 вдоль боковой части.

Остановите ферментативную дехорионацию быстрым, но бережным промыванием, как только можно будет наблюдать первые несколько дехорионизированных эмбрионов. Для трансплантации выбирайте только дехорионированные эмбрионы, которые имеют симметричную клеточную массу и не имеют явных деформаций или повреждений желтка. Чтобы провести трансплантацию бластулы, установите иглу в иглодержатель и подсоедините ее к трубке трансплантационной установки.

Проверьте герметичность, вручную управляя шприцем, чтобы всасывать жидкость внутрь иглы и из нее. Далее с помощью стеклянной пипетки перенесите донорские эмбрионы в первую колонку агарозной формы. Затем перенесите эмбрионы хозяина в столбцы со второй по шестую из агарозной плесени.

Осторожно направьте трансплантационную иглу на клетки бластомера донорского эмбриона и медленно втяните от 20 до 50 клеток в трансплантационную иглу. Избегайте вытягивания желтка. С помощью микроманипулятора приподнять трансплантационную иглу из донорского эмбриона.

Сдвиньте чашку для инъекций влево и вставьте кончик иглы для трансплантации через боковую часть клеточной массы в полюс животного первого эмбриона-хозяина. Отложите от 5 до 10 клеток вблизи поверхности в соответствии с картографированием судьбы, показывающим, что эта область дает начало глазному полю переднего мозга. Чтобы поместить эмбрионы для визуализации, наберите не более пяти эмбрионов в пластиковую пипетку для переноса и дайте эмбрионам накапливаться в наконечнике под действием силы тяжести.

Прикоснитесь пипеткой для переноса к поверхности предварительно подготовленной пластиковой пробирки, содержащей 1% низкоплавкую агарозу, что позволит эмбрионам погрузиться в пробирку, ограничивая при этом количество переноса E3. Далее перенесите пять эмбрионов из агарозной пластиковой пробирки в чашку Петри с 0,5 до одного миллилитра агарозы, и с помощью той же переводной пипетки удалите излишки агарозы так, чтобы осталась лишь небольшая капля. Используйте микрозагрузочную пипетку с отломанным кончиком, чтобы выровнять эмбрионы в поперечном направлении, пока агароза не затвердеет.

Затем продолжайте монтирование до пяти эмбрионов за один раз, в отдельные агарозные капли. При визуализации с помощью вертикального микроскопа избегайте размещения эмбрионов в пределах одного сантиметра от окружности чашки Петри. Используйте дополнительную 1% низкоплавкую агарозу, чтобы соединить капли агарозы друг с другом на боковой стороне чашки, чтобы предотвратить смещение и боковое смещение во время визуализации.

Выбирайте эмбрионы с правильным углом установки и сильным сердцебиением, а также несколько трансплантированных донорских клеток, в первую очередь в передний вентральный квадрант развивающейся сетчатки, где начинается волна экспрессии генов. Проводите визуализацию в соответствии с текстовым протоколом. Как показано на этом рисунке, микроинъекция одного нанолитра мРНК в желток эмбрионов на стадии одной клетки приводит к экспрессии флуоресцентного репортерного белка через три часа после оплодотворения, на котором отбираются самые яркие доноры.

Через 24 часа после оплодотворения эмбрионы с трансплантированными донорскими клетками в соответствующих местах сетчатки подвергались покадровой визуализации в течение 16-24 часов. Это конфокальное изображение одного оптического Z-сечения показывает наложение светлого поля в красных каналах на развивающемся глазу, с несколькими мечеными донорскими клетками красного цвета в немеченой среде хозяина. Эти микрофотографии получены на основе покадровой визуализации развивающихся донорских клеток дикого типа из трансгенных эмбрионов atoh7:gapGFP, трансплантированных немеченному хозяину дикого типа.

Начало экспрессии трансгенов показано для нескольких клеток, как показано здесь. После освоения микроинъекции могут быть сделаны за два часа, а отбор, подготовка и трансплантация эмбрионов могут быть завершены за три часа в тот же день. После этих процедур или параллельно с ними мы также можем зафиксировать эмбрионы в определенном возрасте для посмертного анализа.

Например, мы можем количественно определить, какая доля донорских клеток экспрессирует определенный ген или белок, имеет определенную морфологию или мигрировала в определенное место. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как генетически манипулировать эмбрионами рыбок данио и создавать химеры между генетически отличным донором и хозяином. Вы также должны иметь возможность монтировать эмбрионы для покадровой визуализации in vivo, чтобы ответить на вопросы, на которые невозможно ответить в фиксированной ткани.