G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1

Общая цель этого метода заключается в выделении белка G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 из бактериальной экспрессии с использованием уникальной АТФ-зависимой стадии очистки для выделения почти чистого и каталитически активного фермента. Этот метод может помочь исследователям получить почти чистый и каталитически активный рекомбинантный белок G4 Resolvase1 для нас в широком спектре биохимических анализов in vitro. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она исключает неправильно свернутый или иным образом каталитически неактивный фермент из белкового препарата.

Идея использовать АТФ для элюирования геликазы G-квадруплекса возникла после того, как он не смог вымыть каталитически активный фермент из гранул G4 даже при исключительно высоких концентрациях соли. Готовьте и выращивайте большие бактериальные культуры, экспрессирующие G-квадруплекс Resolvase1 или G4R1, как описано в текстовом протоколе. Разморозьте бактериальную гранулу в трех миллилитрах TN-буфера при комнатной температуре.

Держите бутылки в руках и взбалтывайте, чтобы разморозить и повторно суспендировать бактериальную гранулу. После размораживания и относительно равномерной суспензии доведите объем до пяти миллилитров с TN-буфером. Далее растворите 20 миллиграммов лизоцима в 250 микролитрах воды на культуру и добавьте к ресуспензии бактерий.

Дайте лизоциму переварить бактерии в течение примерно 5-10 минут, поворачивая бутылки в руках. Цвет суспензии начнет немного светлеть по мере протекания пищеварения, и суспензия будет относительно невязкой. Добавьте 250 микролитров коктейля ингибитора протеазы сокращенно PIC.

Затем добавьте одну 10 микролитров аликвоты лейпептина и тщательно перемешайте. Поместите суспензию на лед и добавьте 10 миллилитров холодного TN-буфера и 22 микролитра бета-меркаптоэтанола или BME. Переложите суспензию в трубку объемом 50 миллилитров.

Ультразвуком нанесите бактерии на льду с помощью цифрового ультразвукового аппарата, настроенного на амплитуду 30%. Импульс через две секунды включен и на две секунды выключен в течение одной минуты. Повторите обработку ультразвуком три раза, давая образцам остыть на льду в течение не менее двух минут между этапами обработки ультразвуком.

Затем добавьте равный объем холодных четырех X физиологического раствора цитрата натрия или SSC плюс BME, PIC и лейпептин и смешайте суспензию. В настольной центрифуге, предварительно охлажденной до четырех градусов Цельсия, центрифугируют лизаты в 2,300 раза G в течение 20 минут. Затем переложите надосадочную жидкость в свежие предварительно охлажденные 50 миллилитровые трубки.

Возьмите один миллилитр парамагнитных шариков стрептавидина или суспензии SPB на культуру и переложите его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Прикатываем СПБ с помощью магнита. Затем дважды промойте SPB двумя X SSC плюс пять миллимоляров EDTA PH8.

Далее повторно суспендируйте промытый СПБ в 200 микролитрах того же раствора. Добавьте в суспензию SPB одну аликвоту с тремя наружными диаметрами G4 DNA. Быстро перемешайте, несколько раз перемешав пипеткой вверх и вниз.

Затем поместите трубки на вращатель и вращайте при комнатной температуре не менее 30 минут. После этого периода вращения заблокируйте связанный G4 SPB, добавив один миллилитр 0,4% лактальбумина, и держите на льду до тех пор, пока это не понадобится. Чтобы связать меченный гистидином рекомбинант G4R1 с кобальтовыми шариками, добавьте один миллилитр кобальтовой суспензии в каждую 50-миллилитровую пробирку, содержащую осветленный бактериальный лизат.

Инкубируйте смесь в течение 20 минут при комнатной температуре на ротаторе. После инкубации раскрутите кобальтовые шарики в 110 раз G в течение пяти минут в настольной центрифуге с температурой 4 градуса Цельсия. Осторожно отсадите жидкость, и оставьте пару миллилитров жидкости, чтобы не потревожить гранулированные шарики кобальта.

Затем промойте бусины от 10 до 15 миллилитров холодных четырех X SSC плюс BME и гранулируйте бусины, как и раньше. Налейте следующий осветленный лизат на гранулированные кобальтовые шарики. Инкубируйте еще 20 минут при комнатной температуре на ротаторе и промойте шарики 10-15 миллилитрами четырех X SSC плюс BME.

Затем обваляйте шарики при 100-умно-умножении на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После повторного промывки отсадите жидкость и оставьте на дне тюбика около двух миллилитров шариков и жидкости. Перенесите связанные с белком кобальтовые шарики в предварительно охлажденную двухмиллилитровую трубку с помощью наконечника для пипетки шириной в один миллилитр.

Кратковременно центрифугируйте шарики в двухмиллилитровой пробирке на высокой скорости в микроцентрифуге при температуре четыре градуса Цельсия. Аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, стараясь не потерять связанные с белком кобальтовые шарики. Пипеткой нанесите 0,5 миллилитра гистидинового элюирующего буфера, или HEB, на шарики и ресуспендируйте их, перевернув пробирку.

Затем инкубируйте кобальтовые шарики в HEB на ротаторе в течение пяти минут в холодном помещении. Затем центрифугируйте суспензию при 18 000 умноженных на G в микроцентрифуге с температурой 4 градуса Цельсия в течение одной минуты. Аккуратно удалите содержащую белок надосадочную жидкость путем тщательного пипетирования, оставив небольшое количество жидкости поверх кобальтовых шариков.

Переложите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную 15 миллилитровую трубку. Повторите эти шаги в общей сложности для трех элюций HEB. Затем один раз элюируйте 0,2 моляра ЭДТА при PH 6,0.

Цвет кобальтовых шариков будет меняться с розового на белый, поскольку ЭДТА хелатирует кобальт. После того, как это четвертое и последнее элюирование было перенесено в 15-миллилитровую пробирку, пипеткой удалите остаточный буфер для элюирования из кобальтовых шариков с помощью гелеобразного наконечника на конце одномиллилитрового наконечника для пипетки. Опуская кончик на дно пробирки, можно собрать остаточный белок, содержащий элюирующий буфер

Подправьте подготовленный G4 SPB к боковой стороне пробирки с помощью магнита и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте один миллилитр трех буферов X res в G4 SPB и перемешайте пипеткой. Пипетка G4 SPB, взвешенная в трех X разрешениях буфера, в 15-миллилитровую пробирку, содержащую примерно два миллилитра белка, содержащего HEB EDTA.

Выдерживайте в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с периодическим помешиванием, чтобы шарики не осели. После промывки связанного белка G4 SPB как описано в текстовом протоколе гранулы G4 SPB с помощью магнита на льду и ресуспендируют шарики в 100 микролитрах предварительно подогретого элюирующего буфера. Немедленно переложите шарики в предварительно нагретую ПЦР-пробирку и инкубируйте в течение 30 секунд при температуре 37 градусов Цельсия.

Быстро добавьте 12 микролитров пяти моляров хлорида натрия и энергично пипеткой вверх и вниз от 20 до 30 раз. Комбинация высокого содержания соли и АТФ, содержащихся в элюирующем буфере, служит для элюирования рекомбинантного G4R1 из гранул G4. Немедленно гранулируйте G4 SPB с помощью магнита, а содержащий белок элюат перенесите в свежую пробирку для ПЦР на льду.

После повторения элюирования и переноса конечным продуктом является примерно 200 микролитров элюирующего буфера, содержащего очищенный рекомбинант G4R1. Наконец, проведите анализ ферментативной активности контроля качества, чтобы проверить, был ли высокоактивный рекомбинантный G4R1 очищен, как описано в текстовом протоколе. Анализ G4 позволяет измерить ферментативную активность рекомбинантного G4R1.

В диапазоне от 0,2 до 0,013 мкл в ферменте обычно наблюдается, что 50% 0,2 пикомолев тетраметилродамина, меченной тетрамолекулярной ДНК G4, превращаются в мономеры. Стенд Кумасси очищенного рекомбинанта G4R1 указывает на одну полосу при ожидаемом размере 120 килодальтон с незначительной загрязняющей полосой примерно в 75 килодальтонах. Эта полоса может представлять собой усеченный рекомбинантный G4R1, который сохранил свою способность связывать шарики ДНК G4 в элюат АТФ-зависимым образом.

Полоса интереса количественно определяется относительно стандартной кривой белка. Согласно этому протоколу, обычно получают 200 микролитров очищенного фермента от 20 до 100 наномоляров на один литр бактериальной культуры. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как очистить белок G4 Resolvase1 от бактериальной экспрессии с помощью уникального АТФ-зависимого этапа очистки для выделения почти чистого и каталитически активного фермента.

После освоения и предварительной подготовки замороженных бактериальных гранул очистка рекомбинантного G4R1 может быть выполнена примерно за шесть часов. Для поддержания оптимальной каталитической активности фермента важно держать препарат на льду, если не указано иное. Всегда используйте ингибиторы протеазы.

Избегайте образования пузырьков в трубках. Быстро заморозьте очищенный фермент и избегайте ненужных циклов замораживания и размораживания. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в этой области к точному определению аффинности связывания и геликазной активности этого белка с широким спектром субстратов ДНК и РНК.

Этот способ также может быть адаптирован для очистки других АТФ-зависимых ферментов нуклеиновых кислот, для которых продукт ферментативной реакции больше не является связывающим субстратом для фермента.