Регистрация цельноклеточных патч-фиксаторов для электрофизиологического определения селективности ионов в канале-каналодопсинах

Общей целью данного эксперимента является определение хлоридной селективности новых светозависимых ионных каналов. Этот метод может ответить на ключевые вопросы биофизики каналродопсинов, такие как амплитуды фототока, кинетика и ионная селективность. Основным преимуществом этого метода является прямое считывание данных об активности биофизического канала, которое быстро и легко воспроизводится.

Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что каждый этап экспериментальной процедуры, начиная с подготовки элементов HEK и заканчивая регистрацией фототоков, должен быть оптимизирован. Посев и транссекцию клеток HEK продемонстрирует Алтина Кляйн. Чтобы начать эту процедуру, взвесьте твердые компоненты по 100 миллилитров внутриклеточных и 500 миллилитров внеклеточных буферных растворов в отдельных стаканах.

А затем добавьте соответствующее количество приготовленных исходных растворов. Далее добавьте сверхчистую воду и тщательно отрегулируйте pH с помощью кислот и оснований. Затем отрегулируйте осмолярность с глюкозой до 290 миллиосмолей и 320 миллиосмолей для внутриклеточных и внеклеточных растворов соответственно.

В ходе этой процедуры в 35-миллиметровую чашку Петри помещают до трех покрытых лизином стеклянных крышек, расположенных рядом. Затем затравите 1,5 умножить по 10 на пятую клетку HEK в два миллилитра стандартного DMEM, дополненного 10%-ным FBS и одним микромолярным ретинолом в каждой посуде. Для трансфекции клеток для каждой чашки приготовьте раствор из двух микрограммов плазмидной ДНК в 250 микролитрах DMEM без FBS и шести микролитрах реагента для трансфекции.

После 15 минут инкубации аккуратно добавьте раствор в клетки. Перед измерением вытащите несколько патч-пипеток с низким сопротивлением с помощью съемника микропипеток и отполируйте их огневым огнем. Храните пипетки в непыльном контейнере в день измерения.

За 30 минут до начала записи включите все компоненты настройки, чтобы они нагрелись до рабочей температуры. Убедитесь, что буферы имеют комнатную температуру. Для начала загерметизируйте измерительную камеру кремнием, чтобы предотвратить утечку внешнего буфера.

Затем поместите в камеру одну покровную крышку и закройте ее. Осторожно заполните камеру внеклеточным буфером, чтобы предотвратить отслоение клеток. Храните чашку Петри вместе с другими крышками в инкубаторе для следующей серии экспериментов.

Затем поместите измерительную камеру под микроскоп с помощью объектива 40X для визуализации клеток. Затем наденьте шнековый мост на электрод ванны и поместите его в камеру вместе с датчиком уровня жидкости и выходом перфузии обработчика ванны. Дважды замените внеклеточный раствор одним миллилитром свежего наружного раствора для удаления остатков питательной среды и отделенных клеток.

Соберите клетки в фокус и найдите трансфицированную клетку, которую необходимо выделить из других клеток. Затем используйте набор трехполосных фильтров и оранжевый свет, чтобы возбудить и визуализировать mCherry. Далее заполните одну из вытянутых пипеток внутриклеточным раствором.

И удалите пузырьки воздуха, перевернув пипетку несколько раз. После этого установите пипетку на держатель пипетки и надавите на нее, чтобы предотвратить засорение наконечника. Найдите кончик патч-пипетки под микроскопом и переместите его близко к клетке с помощью микроманипулятора.

В программном обеспечении для сбора данных запустите испытание мембраны в режиме ванны и подайте шаг напряжения. Проверьте, находится ли сопротивление пипетки в нужном диапазоне от 1,3 до 3,0 мегаом. Затем обнулите токи смещения и отрегулируйте потенциал пипетки, повернув ручку смещения пипетки на усилителе.

Чтобы установить пластырь в конфигурации целой клетки, медленно приближайтесь к ячейке с помощью патч-пипетки сверху и ослабьте положительное давление непосредственно перед прикосновением к ячейке. Иногда конфигурация, прикрепленная к ячейке, формируется сама по себе. После приближения к клетке измените мембранный тест с режима «Ванна» на режим «Патч

Компенсируйте емкость пипетки, поворачивая ручку компенсации емкости пипетки, чтобы получить плоский отклик тестового импульса. Переключите мембранный тест в режим Cell. Затем разорвите пластырь, не разрушая уплотнение, применяя короткие импульсы отрицательного давления или отрицательного давления с возрастающей силой для получения подтверждения всей клетки.

Начните компенсацию последовательного сопротивления, установив два параметра всей ячейки: емкость ячейки и последовательное сопротивление. В последовательной панели компенсации сопротивления включите прогнозирование и коррекцию до 90%Затем включите переключатель компенсации всей ячейки и отрегулируйте параметры всей ячейки итеративным образом, чтобы получить идеально плоскую реакцию испытательного уплотнения. После создания конфигурации всей клетки подождите не менее двух минут перед записью, чтобы обеспечить достаточную замену внутриклеточного раствора через патч-пипетку.

Регистрируйте светоиндуцированные токи при различных удерживающих потенциалах. Затем замените внеклеточный буфер на низкое содержание хлорида в камере не менее пяти раз, не разрушая пластырь, и запишите еще одно соотношение напряжения тока при новой концентрации хлорида. На этом рисунке показано, что при освещении зеленым светом PsACR1 имеет быстрый переходный ток, который быстро затухает до стационарного уровня тока.

После выключения света фототоки затухают до нуля в течение миллисекунд. Снижение концентрации внеклеточного хлорида полностью устраняет направленные наружу фототоки. Изменение внеклеточной концентрации хлорида приводит к смещению инверсионного потенциала, который может быть выведен из графика напряжения тока.

Оценка инверсивных потенциалов на основе нескольких измерений позволяет количественно оценить резкое изменение инверсионного потенциала, вызванное изменением внешней концентрации хлоридов. Поразительно, что измеренные реверсивные потенциалы напрямую соответствуют рассчитанным потенциалам Нернста для хлорида, что подтверждает высокую селективность хлорида PsACR1. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить электрофизиологическую регистрацию фототоков на клетках ГЭК, экспрессирующих каналродопсин.

После освоения вся процедура может быть выполнена за четыре дня, в то время как регистрация фототоков занимает несколько часов. В дополнение к этой процедуре могут быть выполнены сайт-направленный мутагенез и спектроскопические методы для дальнейшего выяснения структурных особенностей и клеточных механизмов каналродопсинов. Определение характеристик и молекулярная инженерия каналродопсина проложили путь исследователям в области нейробиологии к манипулированию возбудимостью выбранных нейронов с помощью света.