Атомно-силовая микроскопия Исследования распознавания повреждения ДНК при восстановлении эксцизии нуклеотидов

Общая цель этого эксперимента с помощью атомно-силовой микроскопии состоит в том, чтобы разрешить взаимодействия белков репарации ДНК с участками повреждения в ДНК и различить различные взаимодействия ДНК различными белковыми комплексами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репарации ДНК, например, как конкретная система репарации ДНК достигает распознавания своих целевых повреждений в ДНК. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем непосредственно видеть и анализировать различные типы комплексов, которые участвуют в процессе распознавания повреждений ДНК.

Демонстрировать процедуру будет Николас Вирт, который использовал этот подход во время своего бакалаврского исследования. Для начала подготовьте подходящий субстрат ДНК, создав одноцепочечный разрыв ДНК в плазмиде. Заполните пробел модифицированными одноцепочечными олигонуклеотидами ДНК и, наконец, линеаризируйте плазменную ДНК с помощью соответствующих ферментов рестрикции.

Для этих экспериментов двухцепочечные субстраты ДНК имеют длину около 1000 пар оснований и содержат повреждение ДНК, а также непарную область, называемую пузырем ДНК для загрузки белка на ДНК. Затем подготовьте образец белковой ДНК для анализа АСМ, сначала пипетируя 10-кратный реакционный буфер и воду в микрореакционную пробирку. Затем добавьте исследуемую ДНК и белки.

Например, здесь 100 наномоляров образца ДНК и по одному микромоляру или каждому из белков эксцизионной репарации эукариотических нуклеотидов XPD и p44. Затем инкубируйте реакцию в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в термоблоке. После инкубации кратковременно раскрутите образец.

Затем подготовьте слюдяную подложку, на которую будет помещен образец. С помощью скальпеля отрежьте кусок слюды размером один на один сантиметр от более крупной полоски. Затем с помощью куска клейкой ленты удалите верхние слои слюды, чтобы получить чистую, плоскую, анатомически гладкую поверхность подложки.

Расширьте образец белковой ДНК в 50-100 раз в буфере для осаждения АСМ и немедленно нанесите 20 микролитров разведенного образца на поверхность слюды. Коэффициент разбавления зависит от концентрации образца. Сразу после осаждения образца на поверхность слюды три-четыре раза промойте образец несколькими миллилитрами отфильтрованной, деионизированной воды и промокните лишнюю жидкость.

Используйте слабую струю азота, чтобы высушить образец феном. Наконец, с помощью клейкой ленты закрепите образец по краям на предметном стекле микроскопа. Поместите образец в середину предметного столика АСМ и с помощью магнитных прокладок закрепите предметное стекло микроскопа на предметном столике.

Затем вставьте наконечник AFM в держатель наконечника. Закрепите наконечник в держателе под зажимом, затянув винт так, чтобы он был плотно прижат к пальцам. После фиксации вставьте держатель наконечника в измерительную головку АСМ.

С помощью позиционирующих винтов переместите образец в центральное положение. Поместите измерительную головку АСМ на верхнюю часть образца, убедившись, что головка устойчиво стоит, а ее ножки находятся внутри углублений предметного столика. Затем выровняйте лазер АСМ на задней панели консольного аппарата для достижения оптимальной мощности сигнала.

Следите за сигналом отражения в видеоокне АСМ, чтобы грубо расположить лазер. Для этой модели АСМ поверните колеса правой и задней стороны измерительной головки АСМ, чтобы отрегулировать положения по осям X и Y лазера АСМ, чтобы направить его по центру на конец консоли. Затем оптимизируйте суммарный сигнал детектора, точно настроив положение лазера с помощью двух колес.

Направьте отражение лазера АСМ на центр детектора путем обнуления различного сигнала от верхнего и нижнего диодов матрицы детектора. Для выполнения этого шага поверните винт с левой стороны измерительной головки для данной модели АСМ. Затем определите частоту пребывания кантилевера, перейдя в окно настройки мастер-панели в программном обеспечении.

Выберите амплитуду, соответствующую одновольтному входу для пьезоприемника, который приводит в движение колебания кантилевера, а затем установите частоту колебаний на отрицательные 5%, немного ниже резидентной частоты. Теперь выполните автоматическую настройку частоты и обнулите фазу колебаний. Оставьте систему до достижения теплового равновесия примерно на час перед началом визуализации, чтобы избежать дрейфа.

Когда вы будете готовы начать визуализацию, на главной панели программного обеспечения установите защитную установку и подготовьтесь к приближению наконечника к поверхности образца, выбрав «Включить». Опустите переднее колесо головки АСМ вручную до тех пор, пока не будет достигнута защитная настройка, или заданное значение. Затем осторожно опустите переднее колесо дальше, пока сигнал датчика Z полностью не распространится влево.

Активируйте виброколебательный стол и закройте звукоизоляционный кожух. Затем опустите заданное значение в программном обеспечении АСМ с помощью колеса хомяка, чтобы точно зацепить наконечник АСМ с образцом. Чтобы получить изображение в режиме постукивания в режиме отталкивания, понижайте заданное значение до тех пор, пока фазовый сигнал не станет немного ниже фазы свободного уровня.

Затем начните сканирование образца. Используйте скорость сканирования 2,5 микрометра в секунду для поверхностей изображения размером четыре микрометра на четыре микрометра или квадраты восемь микрометров на восемь микрометров с разрешением пикселей 2,048 или 4,096 соответственно; и нажмите кнопку «Выполнить сканирование». Предварительный отбор соответствующих белковых комплексов ДНК путем прямого визуального контроля изображений в программном обеспечении АСМ.

Для образцов XPD возможные комплексы включают ДНК XPD p44, а также ДНК XPD и ДНК p44 с явно различными размерами из-за разной молекулярной массы XPD и p44. Измерьте объемы отдельных белковых пиков на ДНК с помощью инструмента сечения в окне анализа, чтобы измерить высоту и диаметр участков белковых пиков с помощью курсоров окна раздела. Используйте эти значения для определения объема пиков с помощью простых математических моделей для проверки сложного типа.

Наконец, откалибруйте систему АСМ с помощью ряда белков с известными молекулярными массами, чтобы перевести эти объемы в приблизительные молекулярные массы белков и белковых комплексов. Для определения дополнительных характеристик, таких как длина фрагментов ДНК, положение белковых комплексов на ДНК и их специфичность к сайту-мишени или углы полосы ДНК, см. прилагаемый текстовый протокол. Здесь показано изображение АСМ с тремя различными типами ДНК-связанных комплексов, которые можно различить на основе их различных размеров.

Комплексы первого класса согласуются только с геликазным активирующим кофактором p44, комплексы второго класса состоят только из белка XPD, а комплексы третьего класса состоят как из XPD, так и из p44, поскольку распознавание легиона XPD требует активации его геликазной активности p44, и только комплексы третьего класса демонстрируют распознавание поражений. Для того, чтобы определить различные стратегии распознавания повреждений, расположение белков на субстратах ДНК было измерено на предмет загрузки белка в пузыре ДНК либо в пяти, либо в трех основных направлениях от поражения ДНК, показанных красным цветом для прокариотических и эукариотических геликаз NER. В распределении положения белка распознавание поражения ДНК можно рассматривать как пик из-за усиленного связывания в месте повреждения ДНК.

Прокариотический геликазу NER UVRB и его эукариотический аналог XPD демонстрируют разные стратегии распознавания поражений CPD, которые указывают на различные предпочтения нитей ДНК. В частности, поражения CPD распознаются на транслоцированной цепи с помощью UVRB, но преимущественно на противоположной, нетранслоцированной цепи с помощью XPD. После освоения этого метода его можно сделать за несколько часов или дней, включая анализ.

Важно работать с высокочистыми образцами белка и ДНК, чтобы иметь возможность интерпретировать особенности на изображениях АСМ и тщательно проектировать субстрат ДНК в зависимости от биологической системы и вопроса, который вы хотите решить. Кроме того, ансамблевые методы, такие как пространственный гель-электрофорез, сдвиг электромобильности или анализы разреза ДНК, конечно, в значительной степени дополняют эти эксперименты с АСМ; и эти методы могут помочь решить дополнительные вопросы, такие как аффинность связывания ДНК или активность эксцизии повреждений ДНК. Этот метод представляет собой относительно быстрый и простой подход к прямой визуализации белковых комплексов ДНК, и эти комплексы дают нам хорошую картину процессов, происходящих в биологической системе.

Конечно, это полезно не только для понимания процессов репарации ДНК, но и может быть применено к другим белковым системам ДНК. После просмотра этого видео у вас должно сложиться довольно хорошее представление о том, как подготовить образец на вашей любимой системе белковой ДНК, как визуализировать его с помощью АСМ и как извлечь полезные параметры для интерпретации ваших данных.