Масс-спектрометрия и люминогенные подходы, основанные на Охарактеризуйте Фазу I метаболических компетентности в

Целью данной процедуры является определение активности цитохромов P450 (CYP) в культурах клеток. CYP являются ключевыми ферментами, участвующими в метаболизме лекарственных средств и токсикантов, и их экспрессия часто не сохраняется in vitro. При культивировании клеток in vitro нормальная экспрессия ферментов CYP часто утрачивается.

Следовательно, многие модели in vitro потенциально ограничивают возможность понимания метаболизма лекарственных средств и токсикантов. Основным преимуществом данного метода является его простота при оценке активности CYP в культивируемых клетках. С использованием зондовых субстратов и ингибиторов представлены различные платформы количественного анализа, включая масс-спектрометрию.

Для начала подготовьте криопробирки с клетками, как описано в текстовом протоколе. В данном протоколе в качестве примера используется линия клеток печени. Работая в стерильных условиях, осторожно откройте криопробирку, чтобы сбросить избыточное давление, затем перенесите содержимое криопробирки пипеткой в пробирку объемом 10 мл, содержащую 9 мл предварительно нагретой до 37 °C среды Williams'E.

Центрифугируйте раствор в течение 10 минут при 400 ×g при комнатной температуре. После удаления супернатанта повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах фирменной среды для размораживания, предварительно нагретой до 37 °C и дополненной глутамином. После подсчета жизнеспособных клеток, как описано в текстовом протоколе, высейте клетки в 24-луночный планшет с коллагеновым покрытием с плотностью 60 000 жизнеспособных клеток на лунку и конечным объемом среды для размораживания 0,5 миллилитра.

Спустя несколько дней культивирования клетки формируют субконфлюэнтную трабекулярную структуру. Оптимальная метаболическая активность обычно наблюдается между седьмым и 10-м днями, и она минимальна на четвертый день. Для подготовки культур дифференцированного эпителия дыхательных путей используйте имеющийся в продаже полностью дифференцированный первичный эпителий дыхательных путей, выращенный на вставке на границе раздела фаз «воздух-жидкость».

С помощью стерильного пинцета осторожно извлеките вставку с клетками из агарозного матрикса и перенесите ее в новую плашку, предварительно заполненную 700 µL запатентованной культуральной среды. Оцените целостность ткани дыхательных путей, используя методы, указанные в текстовом протоколе, такие как трансэпителиальное электрическое сопротивление или частота биения ресничек. Перед началом эксперимента подготовьте две серии вставок для клеток дыхательных путей и лунок для клеток печени, используя не менее трех повторностей.

Используйте одну серию для эксперимента по ингибированию, а другую — только для метаболического зонда. Подготовьте третью серию клеток в качестве контрольного образца среды (холостой опыт). В день проведения эксперимента замените культуральную среду клеток на 450 µL свежей среды.

Добавьте 50 µL среды, содержащей 10-кратный раствор ингибитора CYP, к серии клеток, подготовленных для эксперимента по ингибированию, и проведите преинкубацию в течение 30 минут. Затем замените среду в серии ингибирования на 450 µL свежей среды и добавьте 50 µL среды, содержащей как 10-кратный раствор ингибитора CYP, так и 10-кратный раствор зонд-субстрата. Добавьте 50 µL среды с 10-кратным раствором зонд-субстрата к остальным клеткам, а в контрольные пустые клетки добавьте эквивалентное количество растворителя, разведенного в среде.

После инкубации клеток в течение от нуля до пяти минут для первой временной точки (нулевой фоновый контроль) соберите среду в отдельные маркированные пробирки и заморозьте её для последующей обработки. Затем инкубируйте клетки для второй временной точки в течение 16 часов в клеточном инкубаторе. По окончании периода инкубации соберите среду тем же способом для количественного определения метаболического продукта.

Перенесите 250 µL инкубационной среды в микропробирку объемом 1.5 мл и добавьте стоковый раствор внутреннего стандарта 4-метилумбеллиферона до достижения конечной концентрации 100 нМ. Доведите pH среды до значения от 4.5 до 5.0, добавляя 1 M HCl по 1 µL за раз. Проверьте pH, нанеся от 2 до 10 µL среды на pH-полоску, затем добавьте 150 ед. бета-глюкуронидаза-арилсульфата из Helix pamatia.

После инкубации в течение одного часа при 37 °C остановите реакцию, добавив 250 µL холодного метанола. Испарите растворитель с помощью вакуум-центрифуги при 45 °C. Реконструируйте образцы в 500 µL 30% раствора ацетонитрила в воде.

Для проведения количественного анализа методом масс-спектрометрии внесите по 250 µL каждого стандарта серийного разведения в янтарный стеклянный флакон для ультраэффективной жидкостной хроматографии, предназначенный для инжекции в автосамплер UPLC-MS. Также поместите исследуемые образцы в янтарные флаконы для UPLC и установите их в автосамплер UPLC. После рандомизации всех флаконов запустите анализ на UPLC-MS, используя настройки, подробно описанные в текстовом протоколе, в зависимости от конкретного количественно определяемого зонда.

Используйте инструмент «Quantitate, Build Quantitation Method» в средствах количественного анализа масс-спектрометра для построения калибровочной кривой на основе полученных данных синтетического и внутреннего стандартов, затем с помощью мастера количественного анализа («Quantitation Wizard») выберите серию и образцы для анализа и запустите метод количественного определения. Для индукции CYP1A1, CYP1B1 используйте схему расположения лунок, приведенную в текстовом протоколе. Инкубируйте клетки, предназначенные для индукции, в среде с конечной концентрацией TCDD 10 nanomolar в течение 72 часов.

По истечении этого периода удалите среду, трижды промойте лунки PBS и добавьте свежую среду. Перед инкубацией клеток с люминесцентным репортерным зондом предварительно инкубируйте определенную группу индуцированных клеток в течение 30 минут с ингибитором CYP1A1, CYP1B1 в среде. Добавьте люминесцентный зонд, 6'-хлорэтиловый эфир люциферина, до конечной концентрации 50 µM к неиндуцированным, индуцированным, а также индуцированным с добавлением ингибитора клеткам.

Инкубируйте в течение четырех часов, затем перенесите 25 µL культуральной среды в белый непрозрачный 96-луночный планшет и добавьте 25 µL реагента для детектирования люциферина, provided производителем. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре немедленно считайте планшет с помощью люминометра. Здесь представлены данные об относительной люминесценции, возникающей в результате деалкилирования 6'-хлорэтилового эфира люциферина, которое катализируется CYP1A1 и CYP1B1.

Пример демонстрирует отсутствие ферментативной активности без индукции TCDD. После индукции TCDD наблюдается активность CYP1A1 и CYP1B1 как в клетках печени, так и в клетках дыхательных путей. Наконец, добавление ингибитора CYP1A1 и CYP1B1 альфа-нафтофлавона снижает или полностью устраняет активность CYP.

Для оценки активности CYP2A6 и 2A13 в клетках печени и дыхательных путей с помощью UPLC LC-MS измеряли количество 7-гидроксикумарина, образовавшегося в результате гидроксилирования кумарина ферментом. При нулевом времени инкубации с кумарином обнаруживается только фоновый сигнал. Через 16 часов в обоих типах клеток наблюдается гидроксилирование кумарина с образованием 7-гидроксикумарина.

Наконец, добавление ингибитора CYP2A, 2A13 предотвращает образование 7-гидроксикумарина. После освоения этапы инкубации зонда и количественного определения в данной методике в большинстве случаев могут быть выполнены за несколько часов или в течение одного дня. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить различные анализы метаболизма первой фазы с использованием разных типов клеток, подтверждая специфичность фермента с помощью ингибирования и/или индукции по мере необходимости.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что для различных типов клеток может потребоваться более длительное время инкубации; также необходимо использовать тип клеток, который может служить положительным контролем. Не забывайте, что работа с TCDD может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование полного комплекта средств индивидуальной защиты. Значение данного метода заключается в возможности использования подходящих моделей in vitro для доклинической оценки новых лекарственных препаратов, а также для оценки рисков химических веществ и ингредиентов, используемых в потребительских товарах.