Масс-спектрометрия и люминогенные подходы, основанные на Охарактеризуйте Фазу I метаболических компетентности в In Vitro Клеточные культуры

Целью этой процедуры является определение активности цитохрома Р450, или CYP, в культивируемых клетках. CYP являются ключевыми ферментами, участвующими в метаболизме лекарственных средств и токсикантов, и их экспрессия часто не сохраняется in vitro. Нормальная экспрессия ферментов CYP часто теряется при культивировании клеток in vitro.

Таким образом, многие модели in vitro потенциально ограничивают актуальность понимания метаболизма лекарственных препаратов и токсикантов. Основным преимуществом данного метода является его простота при оценке активности CYP в культивируемых клетках. С использованием зондовых субстратов и ингибиторов представлены различные платформы количественного анализа, включая масс-спектрометрию.

Для начала приобретите криогенные флаконы с клетками, как описано в текстовом протоколе. В приведенном протоколе в качестве примера используется линия печеночных клеток. Во время работы в стерильных условиях осторожно откройте криогенный флакон, чтобы сбросить избыточное давление, затем нанесите пипеткой содержимое криогенного флакона в 10-миллилитровую пробирку, наполненную девятью миллилитрами предварительно нагретой среды Вильямса при температуре 37 градусов Цельсия.

Центрифугируйте раствор в течение 10 минут при 400 умноженных на г при комнатной температуре. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах фирменной среды для размораживания, предварительно подогретой до 37 градусов Цельсия и дополненной глютамином. После подсчета жизнеспособных клеток, как описано в текстовом протоколе, засейте клетки в 24-луночную пластину, покрытую коллагеном, с плотностью 60 000 жизнеспособных клеток на лунку и конечным объемом 0,5 миллилитра размороженной среды.

После нескольких дней в культуре клетки образуют субсливающуюся трабекулярную структуру. Оптимальная метаболическая активность обычно наблюдается между седьмым и десятым днями, а самая низкая — на четвертый день. Для приготовления культур дифференцированного эпителия дыхательных путей используют коммерчески доступные полностью дифференцированные первичные эпителии дыхательных путей, выращенные на границе воздух-жидкость на вкладыше.

С помощью стерильного пинцета аккуратно выбить клеточную вставку из агарозного матрикса и перенести ее на новую пластину, предварительно загруженную 700 микролитрами запатентованной питательной среды. Оцените целостность ткани дыхательных путей с помощью методов, указанных в текстовом протоколе, таких как трансэпителиальное сопротивление или частота биения ресничек. Перед началом эксперимента подготовьте две серии клеточных вставок для клеток дыхательных путей и лунки для клеток печени с минимум тремя репликациями.

Используйте одну серию для эксперимента по ингибированию, а другую — только для метаболического зонда. Подготовьте третий ряд ячеек в качестве пустого носителя для контроля. В день эксперимента замените среду для культивирования клеток 450 микролитрами свежей среды.

Добавьте 50 микролитров среды, содержащей 10-кратный ингибитор CYP, в ряд клеток, подготовленных для эксперимента по ингибированию, и предварительно инкубируйте в течение 30 минут. Затем замените среду в серии ингибиции на 450 микролитров свежей среды и добавьте 50 микролитров среды, содержащей как 10-кратный ингибитор CYP, так и 10-кратную подложку зонда. Добавьте 50 микролитров среды с 10-кратной подложкой зонда в другие ячейки, затем добавьте эквивалентное количество разбавленного в среде носителя в органы управления пустыми ячейками.

После инкубации клеток в течение нуля-пяти минут для временной точки один, нулевого фонового контроля, соберите среду в отдельные меченые пробирки и заморозьте среду для будущей обработки. Затем инкубируйте по времени две клетки в течение 16 часов в клеточном инкубаторе. В конце инкубационного периода соберите среду, используя тот же метод количественного определения продукта метаболизма.

Перелейте 250 микролитров инкубационной среды в микропробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте внутренний стандартный исходный раствор 4-метилумбеллиферона до достижения конечной концентрации 100 наномоляров. Отрегулируйте pH среды до уровня от 4,5 до 5,0, добавляя по одному моляру HCl, по одному микролитру за раз. Проверьте pH, нанеся от двух до 10 микролитров среды на полоску pH, затем добавьте 150 единиц бета-глюкуронидазы арилсульфатазы из Helix pamatia.

После инкубации в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия остановите реакцию, добавив 250 микролитров холодного метанола. Испарить растворитель с помощью вакуумной центрифуги при температуре 45 градусов Цельсия. Восстановите образцы с помощью 500 микролитров 30%-ного раствора ацетонитрила в воде.

Чтобы выполнить количественное определение на основе масс-спектрометрии, добавьте по 250 микролитров каждого серийного стандарта разведения в янтарный стеклянный флакон для жидкостной хроматографии Ultra Performance для инъекций в автоматический пробоотборник UPLC-MS. Также добавьте тестовые образцы в янтарные флаконы UPLC и поместите их в автоматический пробоотборник UPLC. После рандомизации всех флаконов запустите UPLC-MS с настройками, подробно описанными в текстовом протоколе, в зависимости от конкретного зонда, который необходимо количественно оценить.

Используйте инструмент Quantitate, Build Quantitation Method в инструментах количественной оценки масс-спектрометра для создания калибровочной кривой на основе полученного синтетического стандарта и внутреннего стандарта, затем используйте мастер количественной оценки для выбора партии образцов и образцов для количественной оценки и выполнения метода количественного определения. Чтобы вызвать CYP1A1, CYP1B1, используйте схему расположения пластин, найденную в текстовом протоколе. Инкубируют клетки, предназначенные для индукции, с конечной концентрацией 10 наномолярных ТХДД в среде в течение 72 часов.

По истечении этого срока удалите среду, трижды промойте лунки PBS и добавьте немного свежей среды. Перед инкубацией клеток с помощью люминогенного репортерного зонда проводят предварительную инкубацию назначенного подмножества индуцированных клеток в течение 30 минут с ингибитором CYP1A1, CYP1B1 в среде. Добавьте люминогенный пропбе, люциферин 6'хлорэтиловый эфир в конечной концентрации 50 микромоляров к неиндуцированным, индуцированным и индуцированным плюс-ингибиторным клеткам.

Инкубировать в течение четырех часов, а затем переложить 25 микролитров питательной среды в белый, непрозрачный 96-луночный планшет и добавить 25 микролитров реагента для обнаружения люциферина, поставляемого производителем. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре немедленно считайте показания на планшете с помощью люминометра. Здесь представлены относительные люминесценции, получаемые деалкилированием люциферина 6'хлорэтилового эфира, который катализируется CYP1A1, CYP1B1.

В примере отсутствует активность фермента при отсутствии индукции ТХДД. После индукции ТХДД активность CYP1A1, CYP1B1 наблюдается как в печеночных, так и в дыхательных клетках. Наконец, добавление ингибитора CYP1A1, CYP1B1 альфа-нафтофлавона снижает или устраняет активность CYP.

Для оценки активности CYP2A6, 2A13 в печеночных клетках и клетках дыхательных путей измеряли количество 7-гидроксикумарина, продуцируемого путем гидроксилирования кумарина ферментом, с помощью UPLC LC-MS. При нулевой минуте инкубации с кумарином обнаруживается только фон. Через 16 часов наблюдается гидроксилирование кумарина с образованием 7-гидроксикумарина в двух типах клеток.

Наконец, добавление ингибитора CYP2A, 2A13 предотвращает образование 7-гидроксикумарина. После освоения инкубации зонда и количественной оценки в большинстве случаев это может быть выполнено за несколько часов или до суток. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить различные анализы метаболизма первой фазы с использованием разных типов клеток, подтверждая специфичность фермента с помощью ингибирования и/или индукции по мере необходимости.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что для разных типов клеток может потребоваться более длительное время инкубации, и важно включить тип клеток, который можно использовать в качестве положительного контроля. Не забывайте, что работа с ТХДД может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как полное использование средств индивидуальной защиты. Применение этого метода распространяется на использование подходящих моделей in vitro для доклинической оценки новых лекарственных средств и оценки риска химических веществ и ингредиентов, используемых в потребительских товарах.