Универсальный метод паттернирования белки и клетки

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы сформировать клетки или субстраты путем их распределения по сложным, длинным и закрытым микроканалам с помощью простых настольных инструментов, доступных в большинстве биологических лабораторий. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии, касающиеся межклеточных и межбелковых взаимодействий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она проста в выполнении и для нее требуются только инструменты, которые легко доступны в большинстве биологических лабораторий.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что он требует оптимизации условий инкубации клеток и субстратов, выбранных исследователем. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как правильное размещение штампа PDMS и раствора значительно улучшает воспроизводимость эксперимента. Начните с составления схемы микроканала с помощью инструмента для рисования в САПР.

Затем распечатайте рисунок на белой бумаге. Затем используйте изопропанол для очистки предметного стекла, которое достаточно велико для размещения конструкции. А затем просушить затвор с помощью пневматического пистолета.

Прикрепите клейкую ленту к очищенному предметному стеклу, стараясь не задерживать пузырьки воздуха. Затем приклейте скотчем боковые стороны предметного стекла к бумаге с рисунком так, чтобы сторона ленты была обращена вверх. Используйте скальпель, чтобы разрезать ленту на предметном стекле, используя бумажный дизайн в качестве образца.

После разреза снимите ленту с нежелательных участков предметного стекла. Затем промойте предметное стекло изопропанолом, чтобы удалить остатки клея. А затем с помощью пневматического пистолета просушить поверхность.

После нанесения рисунка и очистки запекайте предметную горку в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем аккуратно прокатайте ленту резиновым валиком, чтобы удалить пузырьки воздуха и дать горке остыть до комнатной температуры в чашке Петри. Начните с смешивания 10 частей эластомера PDMS с 1 частью его отвердителя и энергично перемешайте смесь.

Затем поместите смесь в вакуумную камеру, чтобы дегазировать смесь до тех пор, пока не останутся пузырьки воздуха. Налейте слой смеси толщиной 2 мм на форму для клейкой ленты и дегазируйте форму, пока все пузырьки воздуха не исчезнут. После охлаждения с помощью скальпеля отрежьте слой PDMS на расстоянии не менее 5 мм от элементов.

А затем снимите отвержденный PDMS с формы с помощью пинцета. Проделайте одно входное отверстие с помощью 1 мм биопсийного перфоратора, желательно в конце сети микроканалов. Затем очистите слепок PDMS с помощью клейкой ленты, чтобы удалить частицы пыли из устройства.

Простерилизуйте микроканальное устройство PDMS, промыв его раствором 70% эхтанола, а затем стерильной деионизированной водой, и подвергните его воздействию ультрафиолетового излучения в течение 30 минут. С помощью пинцета поместите стерильный слепок PDMS на стерильную стеклянную крышку и слегка надавите кончиком пинцета. Далее поместите каплю поли д лизина в буфере тетрабората натрия на входе микроканалов.

Поместите чашку Петри в вакуум на 10 минут. В течение этого времени наблюдайте за выходом воздуха из канала в виде пузырьков. Отпустите вакуум и наблюдайте, как раствор субстрата поступает в микроканал Инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Затем осторожно снимите штамп PDMS с помощью стерильного пинцета, и трижды промойте рисунок деионизированной водой. Добавьте 1%-ный раствор BSA в защитное стекло, чтобы уменьшить неспецифическую адгезию, и инкубируйте образец в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день аспирируйте раствор BSA.

Чтобы начать непрямое структурирование клеток, приготовьте клеточную суспензию в свободной от сыворотки культуре среде, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Добавьте клеточную суспензию в чашку Петри с рисунком, полностью погрузив узорчатую область в клеточную суспензию. Затем инкубируйте чашку Петри при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе в течение 15 минут, чтобы клетки могли прикрепиться к структурированному субстрату.

После инкубации аспирируйте лишнюю клеточную суспензию из чашки Петри и трижды промойте структурированные клетки PBS, осторожно встряхивая в течение десяти секунд, чтобы удалить неприкрепленные клетки. Затем добавьте соответствующую питательную среду к структурированным клеточным культурам и инкубируйте структурированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия в буферном инкубаторе с углекислым газом. Для непосредственного структурирования клеток сначала простерилизуйте микрофлюидное устройство, промыв его раствором 70% этанола, а затем деионизированной водой.

Затем замочите устройство на ночь в растворе 1% BSA, чтобы предотвратить неспецифическую адгезию клеток к PDMS. Высушите прибор при комнатной температуре, а затем приложите его к дну обработанной культуры ткани чашки Петри. Поместите от 4 до 8 микролитров клеточной суспензии, достаточной для заполнения микроканалов, на входное отверстие, полностью закрывая отверстие.

Затем поставьте чашку Петри в вакуумную камеру на 10 минут. Выпустите вакуум и наблюдайте, как клеточная суспензия течет в микроканал. Инкубируйте чашку Петри при температуре 37 градусов Цельсия в буферном инкубаторе с углекислым газом в течение одного часа.

Затем достаньте чашку из инкубатора и с помощью пинцета осторожно снимите PDMS с чашки. Промойте шаблон PBS, а затем добавьте в чашку Петри среды для клеточных культур. Когда закончите, поместите клетки обратно в инкубатор.

Здесь показаны эмбриональные корковые нейроны крысы, структурированные на поверхности поли-d лизина и ламинина. Расположение клеток демонстрирует общую приверженность узорчатым участкам и рост вдоль полос PDL и ламинина. Здесь показаны миобласты C2C12 с большим увеличением.

Этот тип клеток также прилипает к структурированным участкам и демонстрирует слияние в многоядерные миотрубки. Этот метод также был адаптирован для прямого структурирования клеток, как показано здесь на примере фибробластов. Этот метод прямого моделирования клеток не оказывает негативного влияния на выживаемость клеток.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как флуоресцентная микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с локализацией белка или взаимодействием между клеткой и субстратом. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что правильное размещение капли клеток или субстрата раствора для покрытия всей вкладки имеет решающее значение для успеха. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению управления аксонами фоторецепторов в биологии сетчатки.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как моделировать клетки и подложку с помощью газопроницаемых микрофлюидных устройств PDMS с использованием отрицательного давления. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.