Обнаружение Лиганда-активированный G-белками рецепторы интернализации с помощью конфокальной микроскопии

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы предоставить эффективный и легко интерпретируемый метод обнаружения субклеточной локализации и интернализации экспрессированных белков слияния GPCR в клетках млекопитающих. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области локализации субклеточных белков, такие как интернализация рецепторов и рециркуляция. Главное преимущество данной методики заключается в том, что ее можно использовать легко и эффективно.

Таким образом, этот метод может дать представление о мониторинге и определении местоположения GPCR. И это также может быть применимо к другим системам, таким как цитоплазматический и ядерный белок. После восстановления и передачи клеток HEK293 в соответствии с текстовым протоколом, когда клетки вырастут почти до слияния, выбросьте уравновешенную среду для роста, добавьте два миллилитра PBS и покрутите чашку, чтобы промыть клетки.

Откажитесь от PBS и добавьте один миллилитр трипсина ЭДТА. Чтобы полностью переварить клетки, осторожно перемешайте чашку и отсадите раствор. Затем поместите тарелку в этот инкубатор C02 с водяной рубашкой температурой 37 градусов Цельсия на три минуты.

Пока клетки инкубируются, приготовьте шестилуночную пластину, добавив в каждую лунку по два миллилитра уравновешенной питательной среды. Затем, когда клетки поднимутся со дна посуды, добавьте в чашку один миллилитр уравновешенной питательной среды. Перемешайте с помощью пипетирования и сразу же перенесите по 0,1 миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку подготовленной шестилуночной пластины.

Аккуратно пипетируйте суспензию в лунки и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. На следующий день убедитесь, что клетки сливаются на 85-95%. Затем в две стерильные микроцентрифужные пробирки добавьте в одну пробирку три микрограмма плазмидной ДНК и 100 микролитров восстановленной сывороточной среды.

Тем временем добавьте девять микролитров реагента в одну и 100 микролитров восстановленной среды сыворотки в другую пробирку. Инкубируйте трубки при комнатной температуре в течение пяти минут. Разведенную плазмидную смесь соединить с разведенным реагентом.

Затем аккуратно перемешайте раствор, и выдержите его при комнатной температуре в течение 20 минут. Аспирируйте среду клеток и добавьте 1,5 миллилитра свежего DMEM без FBS. Затем добавьте по каплям 215 микролитров смеси реагентов для трансфекции ДНК в каждую лунку и аккуратно перемешайте, поворачивая пластину.

Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение четырех-восьми часов. Затем замените среду свежей DMEM с 10% FBS. Инкубируйте клетки еще от 24 до 48 часов, прежде чем проводить какие-либо эксперименты.

Эффективность трансфекции может сильно различаться в разных клеточных линиях. Таким образом, в зависимости от конкретного типа используемой ячейки может потребоваться оптимизация процесса нанесения и установки ножей. Удалите питательную среду из шести лунок питательной пластины.

Затем используйте один миллилитр PBS для промывки монослоя клеток. Добавьте 0,5 миллилитра трипсина ЭДТА, перемешайте чашку и отасывайте раствор. Затем инкубируйте культуральную тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут.

Во время инкубации вставьте стерильные покровные стекла диаметром 15 мм в каждую лунку 12-луночного планшета. Повторно суспендируйте клетки в небольшом объеме свежей полной питательной средой и перенесите необходимое количество клеток на 12-луночную пластину с покровными стеклами. Затем инкубируйте клетки в течение 16-24 часов.

Через 16-24 часа инкубации, когда клетки вырастут почти до слияния, добавьте пять микромоляров мембранного зонда укропа в каждую лунку и поместите клетки обратно в инкубатор на 30 минут. Удалите уравновешенную питательную среду и используйте холодный PBS для двукратной промывки клеток. Затем добавьте по одному миллилитру 4% PFA в каждую лунку и взбалтывайте клетки в течение 15 минут, чтобы зафиксировать клетки.

С помощью PBS дважды промойте неподвижные ячейки, затем добавьте от 200 до 300 микролитров DAPI в каждую лунку и выдержите пластину в течение 10 минут при комнатной температуре. После двукратной промывки ячеек PBS осторожно снимите покровные стекла с пластины, а излишки буфера смочите. Переверните покровные стекла на предметные стекла микроскопа, загруженные одной каплей монтажного носителя.

Затем удалите излишки монтажной среды со слайдов. Используя клетки, которые разрослись до близкого к слиянию, удалите уравновешенную питательную среду и добавьте свежую подогретую ДМЭМ. Инкубируйте клетки в течение одного часа.

Обрабатывайте клетки лигандом разной концентрации в течение 30 минут. И обработайте клетки с 10 до отрицательным шестью молярным лигандом в разное время, показанное здесь. Используйте холодный PBS для промывки клеток дважды, затем добавьте по одному миллилитру 4% PFA в PBS в каждую лунку, прежде чем осторожно перемешивать клетки в течение 15 минут.

После двойной промывки элементов в PBS осторожно снимите покровные стекла с лунок пластины и установите их, как только что было показано ранее в этом видео. Чтобы провести конфокальную микроскопию, включите аппаратную часть конфокального микроскопа, включая питание ртутной лампы, микроскоп для ПК, сканер и лазер. Запустите программное обеспечение, затем проверьте конфигурацию и выберите лазер.

Включите различные блоки системы конфокальной микроскопии в соответствии с инструкцией. Поместите подготовленное предметное стекло на предметный столик микроскопа и с помощью контроллера предметного столика расположите образец над линзой объектива. Для масляной иммерсионной линзы добавьте одну каплю кедрового масла на покровное стекло и направьте предметное стекло покровным стеклом лицом к линзе.

В разделе Флуоресценция найдите интересующие вас ячейки, затем переключитесь в режим сканирования и выберите мощность лазера и спектральный диапазон эмиссионного флуорофора. Получайте высококачественные изображения, настраивая интенсивность лазера и другие параметры. На этом рисунке показана экспрессия pEGFP-N1 в клетках HEK293.

Сигнал GFP был обнаружен в цитоплазме и ядре. Здесь показана субклеточная локализация в клетках HEK293 рецепторов гонадотропин-рилизинг-гормона из S-Japonica, или SjGnRHR. Рецепторы EGFP выделены зеленым цветом, а окрашивание Dil, которое выделяет клеточную мембрану, — красным

Видно, что рецепторы локализуются в плазматической мембране. Чтобы визуализировать интернализацию SjGnRHRs, клетки обрабатывали гонадотропин-рилизинг-гормоном в различных концентрациях. Как видно на рисунке, интернализация рецепторов протекала дозозависимым образом, и рецептор был полностью интернализован с поверхности клетки с помощью молярного лиганда от 10 до минус 6

При обработке лигандом от 10 до минус шести моляров в течение различных периодов времени, интернализованные SjGnRHR обнаруживались через 10 минут после моделирования агонистов, а крайняя интернализация происходила через 60 минут. Как было продемонстрировано на клетках HEK293, в обоих экспериментах флуоресцентный гибридный белок SjGnRHR EGFP в первую очередь локализовался на плазматической мембране и был резко и быстро интернализован в клетки. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о том, что клетки должны содержаться в правильных условиях без бактерий, грибков и микоплазменного загрязнения.

После этой процедуры и таких методов, как проверка клеток и иммобилизация, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как второй при прохождении V белковых рецепторов. После каждой разработки эта технология прокладывала путь исследователям в области клеточной биологии и биохимии к изучению локализации и интернализации трансмембранных рецепторов в различных клеточных линиях.