Простой метод для идентификации киназ, которые регулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток посредством высокопроизводительного скрининга ингибиторов

Общей целью этого скрининга является идентификация низкомолекулярных ингибиторов протеинкиназы, которые модулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области передачи сигналов эмбриональных стволовых клеток путем выявления новых сигнальных путей протеинкиназы, которые регулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток. Таким образом, основное преимущество этой методики заключается в том, что скрининг относительно легко выполнить с использованием стандартного лабораторного оборудования и легкодоступных реактивов.

Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, что большинство исследований плюрипотентных сигнальных путей полностью игнорировали огромные волны кинома. Приготовьте покрытые желатином 10-сантиметровые блюда, добавив в 10-сантиметровые тарелки пять миллилитров 0,1% желатина. После инкубации при комнатной температуре в течение пяти минут отсадите желатин и дайте пластине обсохнуть в течение двух минут.

Затем поместите любую стандартную линию мышиных ES-клеток на покрытые поверхность чашки в стандартную среду для ES клеток мыши, содержащую 100 нанограммов на миллилитр LIF, меченного GST, 10% фетальную сыворотку теленка и 5% нокаутирующую замену сыворотки. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия 5% CO2 и заменяйте среду каждый день. Проходите мышиные ЭС-клетки со скоростью около 80% конфлюенции каждый второй день путем аспирации среды и промывания пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера на каждую пластину.

Затем добавьте один миллилитр трипсина ЭДТА на пластину мышиных ЭС-клеток и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. После инкубации повторно суспендируйте трипсинизированные клетки в четырех миллилитрах среды и центрифугируйте клетки при 1200 об/мин в течение пяти минут. Тщательно повторно суспендируйте полученную клеточную гранулу в пяти миллилитрах среды, пипетируя вверх и вниз для получения одноклеточной суспензии.

Подсчитайте клетки, соединив 10 микролитров клеточной суспензии и 10 микролитров трипанового синего. Поместите смесь в камеру для подсчета клеток или используйте гемоцитометр и световой микроскоп. Затем с помощью многоканальной пипетки засейте 3000 мышиных ES-клеток в 96-луночные планшеты, покрытые желатином, с 0,1% желатиновым покрытием в конечном объеме 100 микролитров среды.

Затем применяйте ингибиторы киназы в разведении от одного до 100 с помощью многоканальной пипетки. Аккуратно пипетируйте среду, чтобы смешать ингибитор и клеточную суспензию. Затем дайте клеткам осесть в шкафу для культуры тканей в течение одного часа, чтобы обеспечить равномерное распределение по поверхности покрытия.

Культивируйте клетки в течение 48 часов, не меняя среду. Чтобы начать скрининговый анализ, промыть 96 лунок мышиных клеток ES в 200 микролитрах PBS с помощью многоканального аспиратора и пипеток. После промывки смешайте клеточные экстракты в 150 микролитрах буфера для лизиса.

Осветите экстракты центрифугированием при 1500-кратном G в течение 30 минут в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Затем иммобилизуйте 100 микролитров надосадочной жидкости на нитроцеллюлозную мембрану с помощью вакуумного точечного многообразия на 96 лунок. Высушите мембрану и покрасьте 40 миллилитрами Ponceau S, чтобы обеспечить равномерный перенос.

После промывания мембраны с TBST залейте ее в TBST плюс 3% молока. Затем инкубируйте мембрану в антителах Nanog и Dnmt3b в разведении от одного до 1000 в блокирующем буфере на ночь. На следующий день промойте мембрану три раза по 10 минут в TBST.

Затем инкубируйте его в 30 миллилитрах вторичных антител в разведении от одного до 10 000 в блокирующем буфере. Проявите мембрану с помощью цифровой системы иммуноблоттинговой визуализации. Перед тем, как продолжить, крайне важно валидировать ингибиторы киназы, идентифицированные в скрининге, с помощью обычного иммуноблоттинга.

Это помогает устранить ложные срабатывания перед дальнейшим анализом. Проанализируйте данные скрининга и подтвердите наличие ингибиторов в качестве добросовестных регуляторов плюрипотентности, как описано в текстовом протоколе. Здесь показан репрезентативный точечный график Nanog с выполненного экрана.

Выделены ингибиторы положительного контроля, которые приводят к затравленной или наивной плюрипотентности. Также показана репрезентативная точечная диаграмма Dnmt3b с выполненного экрана. Снова выделены ингибиторы положительного контроля, которые приводят к затравленной или наивной плюрипотентности.

На этом графике ингибиторы были ранжированы по соотношению Nanog к Dnmt3b. Двукратное пороговое соотношение Nanog к Dnmt3b установлено для идентификации ингибиторов, которые стабилизируют наивную или запланированную плюрипотентность. Также предусмотрены суммированные сигналы Nanog и Dnmt3b.

Кроме того, отмечаются ингибиторы киназ, выбранные для дальнейшей валидации. Здесь показана обычная иммуноблоттинговая валидация выбранных ингибиторов киназ, иммуноблотов Nanog и Dnmt3b, а также соотношение Nanog к Dnmt3b и общий сигнал. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как идентифицировать низкомолекулярные ингибиторы киназы, которые модулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 72 часа при правильном выполнении. Хотя этот метод может дать представление о сигнальных путях киназы, которые контролируют плюрипотентность, он также может быть применен к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток и других регуляторных систем, таких как эпигенетические модификаторы. После этой процедуры другие библиотеки низкомолекулярных ингибиторов, такие как нацеленные на эпигенетические модификаторы, могут быть использованы для идентификации новых участников в регуляции плюрипотентности.

После его разработки этот метод проложил путь для нашей исследовательской группы к выяснению новых сигнальных путей плюрипотентности. Мы используем этот метод для определения новой роли усиленного пути в регуляции плюрипотентности.