In Vitro визуализации и количественному Таргетинг эффективности наркоконтроля флуоресцентно меченных ГнРГ Аналогов

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании и прогнозировании эффективности систем доставки лекарств на основе ГнРГ в культурах раковых клеток человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области таргетной противораковой терапии, например, насколько эффективно клетки различных типов рака человека принимают таргетные противораковые препараты ГнРГ. Основное преимущество этого метода заключается в том, что в нем используются новые флуоресцентно меченные аналоги ГнРГ, которые позволяют одновременно использовать конфокальную микроскопию и анализ проточной цитометрии.

Применение этого метода распространяется на противораковую терапию, поскольку рецепторы ГнРГ высоко экспрессируются на нескольких типах раковых клеток, что позволяет селективно нацеливаться на них. Демонстрировать процедуру будет Бьянка Гурби, аспирант из моей лаборатории. Для начала удалите культивируемую среду из каждой из семи лунок засеянного микроскопического предметного стекла.

Затем добавьте 250 микролитров предварительно нагретой полной среды в отрицательную контрольную лунку и 250 микролитров предварительно нагретой среды для обработки семян ГнРГ в каждую из оставшихся шести лунок. Инкубируйте предметное стекло в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, пятипроцентном углекислом газе в течение пяти часов. После пяти часов инкубации отсадите среду из каждой лунки и промойте клетки 250 микролитрами PBS.

Впоследствии в каждую лунку добавьте по 250 микролитров фиксирующего раствора и выдержите предметное стекло при комнатной температуре в течение 10 минут. Как только клетки будут закреплены, выбросьте фиксирующий раствор и промойте клетки 250 микролитрами PBS. Добавьте в каждую лунку по 250 микролитров пятимолярного раствора флуоресцентного зонда, приготовленного в PBS, и выдержите предметное стекло при комнатной температуре в течение 10 минут.

После удаления раствора флуоресцентного зонда дважды тщательно промойте клетки 250 микролитрами PBS. Наконец, добавьте три-четыре капли монтажной среды в каждую лунку. Держите предметное стекло в темноте при комнатной температуре, пока оно не будет сфотографировано под микроскопом.

Удалите отваленную среду из каждой из пяти лунок засеянным микроскопическим предметным стеклом. Далее добавьте 250 микролитров предварительно подогретой полной среды в отрицательную контрольную лунку и во вторую лунку с необработанными клетками. Предварительно обработайте клетки в трех оставшихся лунках предварительно нагретой обрабатывающей средой, содержащей 10 микромоляров ГнРГ FITC.

Инкубируйте предметное стекло в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, пятипроцентном углекислом газе в течение одного часа. После этого удалите среду только из обработанных клеток и промойте клетки 250 микролитрами предварительно подогретой готовой среды. Далее удалите средство для промывки.

Затем добавьте по 250 микролитров предварительно разогретой полной среды в каждую из трех лунок. Инкубируйте предметное стекло в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, пятипроцентном углекислом газе в течение одного часа. После инкубации выбросьте среду из всех пяти лунок и промойте клетки 250 микролитрами PBS.

Затем снимите ПБС и зафиксируйте ячейки 250 микролитрами фиксирующего раствора при комнатной температуре на 10 минут. Далее откажитесь от фиксирующего раствора и промойте клетки 250 микролитрами PBS. Добавьте в каждую лунку по 250 микролитров блокирующего раствора и выдержите предметное стекло при комнатной температуре в течение одного часа.

Аспирация блокирующего раствора из каждой лунки за исключением отрицательного контроля. Промыв клетки 250 микролитрами PBS, добавьте в каждую лунку по 250 микролитров раствора первичного антитела. Выдержите предметное стекло при комнатной температуре в течение одного часа в темном месте.

Удалите растворы из каждой из пяти лунок и промойте ячейки 250 микролитрами PBS. Затем удалите PBS и добавьте 250 микролитров вторичного раствора антитела. Выдержите предметное стекло при комнатной температуре в течение одного часа в темноте.

Отсадите раствор из каждой лунки и промойте клетки 250 микролитрами PBS. Удалите промывочный PBS, а затем добавьте в каждую лунку 250 микролитров PBS, содержащего пять микромолярных флуоресцентных зондов. Выдержите предметное стекло в течение 10 минут при комнатной температуре.

Удалите раствор флуоресцентного зонда из каждой лунки и дважды тщательно промойте клетки 250 микролитрами PBS. Наконец, добавьте три-четыре капли монтажной среды в каждую лунку. Держите предметное стекло в темноте при комнатной температуре до тех пор, пока оно не будет получено под микроскопом.

Визуализируйте клетки под инвертированным конфокальным лазерным сканирующим микроскопом. Включите лазеры на 488 нм и 633 нм. Проверьте усиление лазера и размер точечного отверстия.

Сфотографируйте отрицательный контрольный образец. Оптимизируйте наблюдаемый сигнал для ядра и настройте сигнал FITC и Alexa 546 так, чтобы он был близок к нулю. Затем, используя те же параметры, визуализируют обработанные образцы.

Выбросьте полную среду из всех семи лунок засеянной культурной пластины. Затем добавьте один миллилитр предварительно нагретой полной среды в отрицательную контрольную лунку и один миллилитр предварительно нагретой рабочей среды в остальные шесть лунок. Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, пятипроцентном углекислом газе в течение пяти часов.

Выбросив среду из всех лунок, тщательно промойте клетки дважды двумя миллилитрами PBS. Удалите PBS, а затем добавьте по 500 микролитров раствора Trypsin EDTA в каждую лунку. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока клетки не отделятся, что займет примерно 10 минут.

Используя один миллилитр готовой среды, нейтрализуйте трипсин в каждой лунке и встряхните пластину. После этого подвешивайте клетки с помощью аккуратного пипетирования. Переложите суспензии в отдельные пробирки FACS и центрифугируйте образцы при 150-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия в течение четырех минут.

Осторожно сцедите надосадочную жидкость. Затем добавьте 500 микролитров ледяного PBS в каждую пробирку FACS и аккуратно ресуспендируйте клетки. Держите трубки на льду до тех пор, пока они не будут проанализированы с помощью FACS.

Представлен анализ поглощения ГнРГ в клетках карциномы глотки. Пятичасовое лечение одним микромолем флуоресцентного комплекса ГнРГ приводило к незначительному, но различимому поступлению, проявляющемуся в виде зеленого флуоресцентного сигнала, локализованного в раковых клетках глотки. Дополнительное увеличение комплексной дозы приводило к усилению поглощения, демонстрируя дозозависимость поглощения ГнРГ в клетках карциномы глотки.

Рецептор-зависимое поглощение ГнРГ и клеточное распределение лиганда в его рецепторе в клетках рака легкого анализировали путем одновременной обработки флуоресцентным комплексом ГнРГ и окрашивания рецептора и ядер ГнРГ первого типа. Результаты показывают, что рецептор ГнРГ первого типа связан с клеточной мембраной, в то время как белок ГнРГ интернализуется в клетках и остается в их цитоплазме. Поглощение ГнРГ в клетках карциномы глотки также изучалось с помощью анализа FACS.

Результаты показывают, что поглощение ГнРГ, наблюдаемое при обработке клеток одним микромоляром конъюгата ГнРГ, значительно увеличивается при увеличении дозы, применяемой к клеткам, до 10 микромоляров. После освоения этой техники ее можно закончить за восемь часов, если она выполнена правильно. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости защищать обработанные образцы и флуоресцентные красители от прямого света.

После этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как анализ жизнеспособности клеток или апоптоз, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, насколько эффективно таргетный препарат ГнРГ может ингибировать рост данного типа рака. После этой разработки этот метод проложил путь исследователям в области терапии рака к изучению эффективности систем доставки лекарств на основе ГнРГ в адгезивных раковых клетках. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как использовать эти флуоресцентно меченые конъюгаты ГнРГ для изучения восприимчивости раковых клеток к таргетной терапии ГнРГ.