In Vitro визуализации и количественному Таргетинг эффективности наркоконтроля флуоресцентно меченных ГнРГ Аналогов

Общая цель данной процедуры заключается в исследовании и прогнозировании эффективности систем доставки лекарственных средств на основе GnRH в культурах раковых клеток человека. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области таргетной противоопухолевой терапии, например, насколько эффективно клетки различных типов рака человека поглощают противоопухолевые препараты, нацеленные на GnRH. Основным преимуществом данного метода является использование новых флуоресцентно меченных аналогов GnRH, которые позволяют одновременно применять конфокальную микроскопию и анализ методом проточной цитометрии.

Значение этого метода распространяется на противоопухолевую терапию, поскольку рецепторы GnRH экспрессируются в большом количестве в нескольких типах раковых клеток, что позволяет осуществлять их селективное воздействие. Процедуру продемонстрирует Бианка Гурби, аспирантка из моей лаборатории. Для начала удалите культуральную среду из каждой из семи лунок на засеянном предметном стекле.

Затем добавьте 250 µL предварительно подогретой полной среды в лунку отрицательного контроля и по 250 µL предварительно подогретой среды для обработки посевного материала GnRH fit в каждую из шести оставшихся лунок. Инкубируйте предметное стекло в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение пяти часов. После пятичасовой инкубации аспирируйте среду из каждой лунки и промойте клетки 250 µL PBS.

Затем добавьте по 250 µL фиксирующего раствора в каждую лунку и инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в течение 10 минут. После фиксации клеток удалите фиксирующий раствор и промойте клетки 250 µL PBS. Добавьте по 250 µL раствора флуоресцентного зонда с концентрацией 5 µM, приготовленного в PBS, в каждую лунку и инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в течение 10 минут.

После удаления раствора флуоресцентного зонда осторожно промойте клетки дважды, используя 250 µL PBS. В завершение добавьте по три-четыре капли среды для заключения в каждую лунку. Храните предметное стекло в темноте при комнатной температуре до момента получения изображений с помощью микроскопа.

Удалите культуральную среду из каждой из пяти лунок засеянного предметного стекла. Затем добавьте 250 µL предварительно нагретой полной среды в лунку с отрицательным контролем и во вторую лунку с необработанными клетками. Проведите предварительную обработку клеток в трех оставшихся лунках предварительно нагретой средой для обработки, содержащей 10 µM GnRH FITC.

Инкубируйте предметное стекло в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ в течение одного часа. После этого удалите среду только с обработанных клеток и промойте клетки 250 µL предварительно нагретой полной среды. Затем удалите промывочную среду.

Затем добавьте по 250 µL предварительно нагретой полной среды в каждую из трех лунок. Инкубируйте предметное стекло в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение одного часа. После инкубации удалите среду из всех пяти лунок и промойте клетки 250 µL PBS.

Затем удалите PBS и зафиксируйте клетки, добавив 250 microliters фиксирующего раствора, при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем слейте фиксирующий раствор и промойте клетки 250 microliters PBS. Добавьте в каждую лунку 250 microliters блокирующего раствора и инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в течение одного часа.

Отожмите блокирующий раствор из каждой лунки, за исключением отрицательного контроля. После промывки клеток 250 microliters PBS добавьте в каждую лунку 250 microliters раствора первичных антител. Инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в течение одного часа в темном месте.

Удалите растворы из каждой из пяти лунок и промойте клетки 250 microliters PBS. Затем удалите PBS и добавьте 250 microliters раствора вторичных антител. Инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в течение одного часа в темноте.

Отоспирируйте раствор из каждой лунки и промойте клетки 250 µL PBS. Удалите промывочный PBS, затем добавьте в каждую лунку 250 µL PBS, содержащего 5 µM флуоресцентного зонда. Инкубируйте предметное стекло в течение 10 минут при комнатной температуре.

Удалите раствор флуоресцентного зонда из каждой лунки и осторожно промойте клетки дважды, используя 250 µL PBS. В завершение добавьте по три-четыре капли среды для заключения в каждую лунку. Храните предметное стекло в темноте при комнатной температуре до момента получения изображений под микроскопом.

Выполните визуализацию клеток с помощью инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Включите лазеры с длиной волны 488 nanometer и 633 nanometer. Проверьте усиление лазера и размер диафрагмы (пинхола).

Выполните получение изображения образца отрицательного контроля. Оптимизируйте сигнал, наблюдаемый для ядра, и отрегулируйте сигнал FITC и Alexa 546 так, чтобы он был близок к нулю. Затем, используя те же параметры, получите изображения обработанных образцов.

Удалите всю полную среду из всех семи лунок посевного культурального планшета. Затем добавьте 1 мл предварительно нагретой полной среды в лунку отрицательного контроля и по 1 мл предварительно нагретой среды с препаратом в остальные шесть лунок. Инкубируйте планшет в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение пяти часов.

После удаления среды из всех лунок осторожно промойте клетки дважды, используя по 2 мл PBS. Удалите PBS, затем добавьте в каждую лунку по 500 µL раствора трипсина-ЭДТА. Инкубируйте планшет при 37 °C до открепления клеток, что займет примерно 10 минут.

Используя 1 mL полной среды, нейтрализуйте трипсин в каждой лунке и встряхните планшет. После этого суспендируйте клетки путем осторожного пипетирования. Перенесите суспензии в отдельные пробирки для FACS и центрифугируйте образцы при 150 ×g при 4 °C в течение 4 минут.

Осторожно слейте супернатанты. Затем добавьте по 500 microliters ледяного PBS в каждую пробирку для FACS и аккуратно ресуспендируйте клетки. Храните пробирки на льду до проведения анализа методом FACS.

Здесь представлен анализ поглощения GnRH клетками карциномы глотки. Пятичасовая обработка флуоресцентным комплексом GnRH в концентрации 1 µM привела к незначительному, но заметному поглощению, проявившемуся в виде зеленого флуоресцентного сигнала, локализованного в клетках рака глотки. Дальнейшее увеличение дозы комплекса привело к усилению поглощения, что демонстрирует дозозависимость захвата GnRH клетками карциномы глотки.

Рецептор-зависимое поглощение GnRH и клеточное распределение лиганда по отношению к его рецептору в клетках рака легкого анализировали путем одновременного воздействия флуоресцентного комплекса GnRH и окрашивания ядер и GnRH-рецепторов первого типа. Результаты показывают, что GnRH-рецептор первого типа связан с клеточной мембраной, в то время как белок GnRH интернализуется в клетки и остается в их цитоплазме. Поглощение GnRH в клетках карциномы глотки также было изучено с помощью анализа FACS.

Результаты показывают, что поглощение GnRH, наблюдаемое при обработке клеток конъюгатом GnRH в концентрации 1 µM, значительно усиливалось при увеличении дозы, вводимой в клетки, до 10 µM. После освоения данной методики ее выполнение при соблюдении всех правил занимает восемь часов. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости защищать обработанные образцы и флуоресцентные красители от прямого света.

После выполнения данной процедуры можно провести другие методы анализа, такие как определение жизнеспособности клеток или анализ апоптоза, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, насколько эффективно препарат, мишенью которого является GnRH, может подавлять рост данного типа рака. Эта разработка открыла исследователям в области терапии рака путь к изучению эффективности систем доставки лекарств на основе GnRH при их связывании с раковыми клетками. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать эти флуоресцентно меченные конъюгаты GnRH для изучения чувствительности раковых клеток к терапии, направленной на GnRH.