Протоколы для исследования распределения Хоста-ткань, Transmission-режим, и эффекта на хост приспособленности Densovirus в хлопковой совке

Общая цель этого протокола заключается в изучении влияния дензовируса, HaDV2, на его хозяина, хлопкового коробочного червя. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия вирусов с хостами, такие как влияние вирусов на их хосты. Основное преимущество этого метода заключается в том, что личинки используют для создания вирусположительных и отрицательных штаммов, полученных от одних и тех же сохозяев, что обеспечивает одинаковый генетический фон.

Чтобы начать эксперимент, было проведено восемь однопарных спариваний только что заключенных бабочек с использованием пластиковой клетки на пару, покрытой ватной марлей, чтобы обеспечить хорошую вентиляцию и служить субстратом для положения яйцеклеток. Чтобы повысить вероятность получения свободной от вирусов колонии, используйте не менее 30 пар однопарных спариваний. Кормите взрослых бабочек ватным шариком, смоченным на 10% сахаром и 2% витаминным раствором, и ежедневно пополняйте раствор.

Сегодня после спаривания, когда взрослые самки откладывают яйца на ватную марлю, начинают менять марлю ежедневно. Собирайте и храните яйца, содержащие марлю, в той же комнате для роста, что и взрослые бабочки, до тех пор, пока яйца не вылупятся. Немедленно пересадите только что вылупившихся личинок в новые 24-луночные планшеты по одной особи на лунку.

Через пять дней после первой даты закладки яиц соберите материнских бабочек и храните их в жидком азоте. Проверьте наличие HaDV2 у родителей с помощью ПЦР с определенными праймерами и оставьте свободных от HaDV2 особей в качестве неинфицированного штамма, свободного от HaDV2. Собирайте взрослых бабочек по отдельности и сразу храните их в жидком азоте.

Полностью измельчите собранные отдельные моли в жидком азоте с помощью стерилизованной ступки и пестика. Перелейте около 10 микрограммов мусора в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем переложите оставшийся мусор в новую пробирку и сразу же храните его при температуре 80 градусов Цельсия.

Извлеките ДНК из 10 микрограммов мусора в соответствии с протоколами, предоставленными производителем. После того, как ДНК моли будет выделена, проверьте наличие HaDV2 с помощью протокола. В соответствии с полученными результатами разделите оставшиеся обломки на две группы: HaDV2 положительные и HaDV2 отрицательные.

Добавьте один миллилитр фосфатно-солевого буфера (PBS) к каждой особи, чтобы полностью растворить оставшиеся остатки личинок. Предварительно охладите центрифугу на четыре градуса Цельсия, затем закрутите гомогенат. На льду отфильтруйте жидкую надосадочную жидкость с помощью мембранного фильтра 0,22 мкм.

Соберите по 200 микролитров на тюбик отфильтрованной жидкости, и сразу же храните их при температуре 80 градусов Цельсия. Для определения эффективности инфицирования полости рта зараженным HaDV2 фильтруют жидкости различной концентрации путем разбавления жидкости, содержащей HaDV2. В вытяжной шкаф равномерно распределите по 200 микролитров HaDV2, содержащего отфильтрованные жидкости для каждой концентрации на поверхности твердого искусственного рациона.

Далее начинайте пересаживать 100 только что вылупившихся личинок в HaDV2, содержащий искусственный рацион питания в чашке Петри. Аккуратно постучите по ватной марле, включая только что вылупившихся личинок, чтобы перенести личинок с марли на лист белой бумаги. Осторожно постучите по бумаге, чтобы личинки скрутили шелк и оторвались от бумаги.

С помощью стерилизованных щипцов коснитесь шелка и переместите личинок в чашку Петри. Через 48 часов переведите одну отдельную личинку на лунку на искусственной диете в 24-луночные планшеты. Повторно заведите личинок, инокулированных HaDV2, используя те же концентрации до взрослой стадии.

Проверьте статус инфекции HaDV2 у взрослых с помощью протокола. Взрослые особи, привитые от 10 до восьмой копий на микролитр HaDV2, дали 100% инфекцию и остаются с положительным штаммом HaDV2. Чтобы предотвратить загрязнение, трижды простерилизуйте щипцы и ножницы в 75% этаноле, а затем нагрейте их в пламени спиртовой лампы.

С помощью аналитических весов взвесьте пустые пробирки, которые будут использоваться для хранения тканей. Далее поместите личинок и взрослых особей моли от зараженного штамма на лед примерно на пять минут. Закрепите замороженных личинок на цистосепименте с помощью двух булавок от насекомых, вставленных в межсегментарные мембраны возле головы и последнего сегмента брюшка.

Затем в задней части брюшка отрежьте проножку личинок так, чтобы гемолимфа вытекала наружу. Используйте пипетку для пипетки около 10 микролитров личиночной гемолимфы в течение примерно 10 секунд, чтобы предотвратить потемнение и коагуляцию гемолимфы. Ножницами сделайте разрез в области кутикулы, начиная от последней межсегментарной мембраны и заканчивая головой.

С помощью двух щипцов рассеките переднюю кишку, среднюю кишку, заднюю кишку, жировое тело и мальпигиевые канальцы. Чтобы предотвратить загрязнение оставшихся тканей гемолимфой во время вскрытия, промойте рассеченные ткани в буфере PBS. Смешайте образцы тканей трех особей вместе как один репликант.

Сразу же перенесите каждую ткань в трубки в жидкий азот. В чистой чашке Петри, содержащей буфер PBS, рассеките ткани взрослых женщин и мужчин и немедленно перенесите каждую ткань в пробирки в жидкий азот. Взвесьте трубки и вышеуказанные ткани вместе по отдельности и рассчитайте массу тканей.

Извлеките ДНК из этих тканей и выполните кПЦР для количественной оценки титра вируса каждой ткани. Поместите не менее 100 куколок или недавно появившихся взрослых бабочек, полученных от неинфицированного штамма, в 5-литровую клетку из проволочной сетки, покрытую ватной марлей. Через два дня спаренные взрослые самки начнут откладывать яйца на ватную марлю.

Соберите и поддерживайте ватную марлю с яйцами. Продолжайте инокуляцию личинок новорожденных, переводя личинок новорожденных неинфицированного штамма на искусственную диету, содержащую HaDV2, для формирования инфицированного штамма. Аналогичным образом, перенесите личинок новорожденных на искусственную диету, покрытую фильтрованной жидкостью, не содержащей HaDV2, чтобы установить контрольные группы, неинфицированный штамм.

Включайте не менее 240 личинок в каждую обработку. Через 48 часов перенесите одну отдельную личинку в лунку на 24-луночные планшеты. Последовательно пронумеруйте каждую личинку в каждой лунке и ежедневно записывайте стадию развития и состояние выживания.

Примерно через пять дней, когда искусственная диета испортится, одновременно переведите этих особей на новую 24-луночную тарелку, содержащую свежую искусственную диету. Взвешивайте личинок с седьмого по 11-й день с помощью аналитических весов. После взвешивания по отдельности верните личинок на 24-луночную пластину.

После линьки до пятого возраста, примерно через десять дней после вылупления, перенесите личинок в стеклянные трубки. Перекладывайте особей в стеклянную трубку в одно и то же время каждый день. Личинки пятого возраста также могут быть идентифицированы по ширине головной капсулы.

Затем закодируйте каждую личинку ее исходным номером на стеклянной трубке с помощью краски или маркеров. Ежедневно записывайте статус личинок. Запишите в стеклянную пробирку куколок и дату выпадения каждой особи, а также запишите массу трехдневных куколок.

После эклозии поместите одну самку и одного самца в одну клетку с 10% сахарозы и 2% витаминным раствором. Пополняйте раствор сахарозы каждый день. Запишите дату смерти каждого мотылька.

Когда яйца снесут, ежедневно меняйте ватную марлю. Посчитайте количество яиц сразу. Наконец, подсчитайте только что вылупившихся детенышей, пока они вылупляются.

Для обеспечения качества образцов, использованных в эксперименте, были проведены триалы. Потомство от родителей мужского и женского пола, у которых мы не содержали HaDV2, было выращено как неинфицированный штамм. Мы успешно амплифицировали ген актина у родителей и потомков, используя одну и ту же матрицу ДНК, что позволяет предположить, что матрицы ДНК имеют хорошее качество.

Случайно выбранные восемь потомков также не содержали HaDV2, HaNPV и Wolbachia. Стандартная кривая, определяющая связь между логарифмом качества исходного материала и полученными значениями СТ, показывает сильную линейную корреляцию между значениями СТ и логарифмом числа копий исходного гена HaDV2. Число копий HaDV2 было рассчитано на микрограмм каждой ткани, и процентное соотношение общего титра HaDV2 для конкретной ткани показало, что HaDV2 в основном распределяется в жировом теле.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно обращаться с нежными личинками в течение первых пяти дней после того, как они вылупятся во время процедуры осеменения.