Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

Общая цель данного эксперимента заключается в оценке влияния бактериальной инфекции на способность клеток хозяина формировать стресс-гранулы в ответ на экзогенный стресс. Этот метод является ценным инструментом в области клеточной микробиологии для определения того, способен ли конкретный патоген изменять или подавлять весь путь формирования стресс-гранул. Основным преимуществом данной методики является возможность строгого и автоматизированного качественного и количественного анализа стресс-гранул с использованием бесплатных программ для анализа изображений.

Данный метод позволяет изучить динамику формирования и состав стресс-гранул, а также влияние на эти параметры конкретного патогена. Благодарим за внимание. Перед началом эксперимента инокулируйте колонию бактерий S.flexneri M90T (красного цвета) с недавно посеянного чашки с триптико-соевым агаром и 1% Congo red в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую восемь миллилитров триптико-соевого бульона.

После плотного закрытия крышки инкубируйте колонию в течение ночи при перемешивании со скоростью 222 RPM и температуре 30 °C. На следующий день перенесите 150 µL бактерий в 8 мл свежего триптиково-соевого бульона и культивируйте примерно два часа при 37 °C и 222 RPM для инициации экспрессии генов вирулентности в поздней экспоненциальной фазе и повышения инфекционности бактерий. Когда оптическая плотность субкультуры достигнет значения от 0,6 до 0,9, перенесите 1 мл бактериальной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл для их сбора путем центрифугирования.

Затем ресуспендируйте осадок в среде для инфицирования до достижения оптической плотности, равной 1. После этого аспирируйте супернатанты из каждой лунки культуры клеток HeLa на покровных стеклах. Осторожно промойте клетки HeLa 500 µL свежей среды для клеток HeLa комнатной температуры на одну лунку.

Замените промывочный раствор 500 µL среды для инфицирования на лунку и центрифугируйте планшет на 24 лунки, чтобы осадить бактерии на клетки. Перенесите осажденные бактериальные кокультуры в тканевый инкубатор при температуре 37 °C на 30 минут для обеспечения инфицирования клеток-хозяев. По завершении инкубации удалите экзогенные бактерии с клеток, трижды промыв их 1 мл свежей культуральной среды HeLa при температуре 37 °C за одну промывку.

Затем залейте инфицированные клетки одним миллилитром свежей культуральной среды, содержащей гентамицин, и верните планшет в инкубатор для культивирования клеток. По окончании инкубации замените среду на 500 микролитров соответствующей культуральной среды с добавлением интересующего стрессора и верните клетки в инкубатор для культивирования тканей. Через один час полностью аспирируйте супернатант и зафиксируйте образцы в 0,5 миллилитрах 4% параформальдегида в PBS комнатной температуры в течение 30 минут.

Затем слейте фиксатор в соответствующий контейнер для отходов и промойте покровные стекла одним миллилитром трис-буферизированного физиологического раствора (TBS) в течение двух минут при осторожном встряхивании. По окончании промывки полностью аспирируйте TBS и проведите пермеабилизацию клеток в каждой лунке, добавив 500 микролитров 0.3% Triton X-100 в TBS. Через 10 минут замените пермеабилизирующий раствор одним миллилитром TBS, аккуратно перемешайте содержимое планшета круговыми движениями, затем замените TBS одним миллилитром блокирующего раствора и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре.

Для маркировки клеток коктейлем из интересующих первичных антител нанесите по 50 µL смеси первичных антител на каждую покровное стекло, используя для этого кусочек пластиковой Парафильма, плотно закрепленный на лабораторном столе. Затем с помощью пинцета возьмите первое покровное стекло и промокните его край салфеткой, чтобы удалить излишки жидкости.

Осторожно поместите покровное стекло на каплю и инкубируйте покровные стекла в соответствующих условиях маркировки. По завершении инкубации с первичными антителами перенесите каждое покровное стекло в отдельную лунку нового 24-луночного планшета, содержащего один миллилитр TBS на лунку, и промойте клетки при комнатной температуре на шейкере в течение пяти минут трижды. После последнего промывания проведите маркировку клеток на каждом покровном стекле с помощью соответствующей смеси коктейля вторичных антител, как было продемонстрировано выше.

Инкубируйте покровные стекла в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. По завершении инкубации с вторичными антителами трижды промойте клетки в одном миллилитре PBS в новом 24-луночном планшете при осторожном встряхивании, как было показано ранее, но в защищенном от света месте. После последнего промывания кратковременно погрузите каждое покровное стекло в деионизированную воду для удаления солей, промокните края стекла салфеткой и аккуратно закройте стекла 5 µL флуоресцентного среды для заключения на каждый предметное стекло, избегая появления пузырьков воздуха.

Затем закрепите покровное стекло с помощью лака для ногтей. Храните предметные стекла соответствующим образом до начала визуализации. Для визуализации клеток с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии начните с выбора подходящего объектива и соответствующих флуоресцентных каналов для регистрации изображений.

Затем с помощью подходящего программного обеспечения для визуализации получите серии изображений (стеки) клеток. После завершения захвата всех изображений используйте соответствующее программное обеспечение для анализа изображений, чтобы объединить серии и сохранить их в виде файлов TIFF. Затем загрузите контрольное и экспериментальное изображения в формате TIFF на платформу для анализа изображений и выберите «Lookup Table», чтобы открыть параметры каналов в окне «Sequence».

Отметьте все флажки в области каналов, чтобы деактивировать все каналы. Затем выберите канал 0 и нажмите на цветную полосу канала 0, чтобы выбрать подходящий цвет, при необходимости увеличивая интенсивность канала для визуализации всех структур. После выбора и настройки каждого из необходимых цветовых каналов для экспериментального анализа перейдите на вкладку холста и отрегулируйте масштаб так, чтобы в одном поле зрения было видно около 10 клеток.

С помощью инструмента «Полигон» (polygon tool) кликните по интересующей клетке и проведите линию вокруг неё, чтобы очертить границы клетки. Чтобы присвоить имя этой области интереса, в окне областей интереса нажмите правой кнопкой мыши на выбранную клетку, а затем дважды кликните по названию области интереса, чтобы изменить его. После выбора и именования всех интересующих клеток аналогичным образом откройте приложение Spot Detector во вкладке «Детекция и трекинг» (detection and tracking).

Откройте вкладку Pre Processing и выберите канал для анализа. На вкладке Detector выберите опцию Detect bright spots over dark background, а затем установите соответствующие масштаб и чувствительность. На вкладке Region of Interest выберите предложенную область интереса из последовательности.

На вкладке Filtering выберите NoFiltering. На вкладке Output выберите соответствующий вариант вывода. Выберите Remove previous spots rendered as regions of interest и нажмите no file selected, чтобы выбрать папку для сохранения файла.

Затем на вкладке Display выберите соответствующие интересующие вас параметры и нажмите Start Detection. В программном обеспечении для анализа изображений можно использовать детектор пятен (spot detector) для идентификации стресс-гранул в каждом из выбранных интересующих областей. После этого можно создать бинарное изображение для визуализации всех выявленных стресс-гранул.

Анализ стресс-гранул должен быть тщательно адаптирован к каждой анализируемой группе стресс-гранул. Например, изменение требований к размеру определяемой области интереса или изменение чувствительности параметров детектирования приводят к разным результатам. При более крупных масштабах размера пикселей мелкие стресс-гранулы не будут учтены, и их общее количество уменьшится.

При этом повышение чувствительности приводит к увеличению количества стресс-гранул. Например, в данном эксперименте масштаб «два» при чувствительности 100 дал наилучший результат для маркера стресс-гранул G3BP1. В то же время масштаб «два» при чувствительности 55 обеспечил наилучший результат для маркера стресс-гранул EIF3B.

Затем площадь поверхности можно рассчитать на основе размера стресс-гранул. Графики распределения частот полезны для выявления сдвигов в размере стресс-гранул между различными популяциями клеток. Кроме того, интенсивность флуоресценции может дать информацию о качестве анализируемых стресс-гранул.

После освоения метода подготовка целых клеток занимает около шести-семи часов, а анализ может быть завершен за последующие два-три часа. При выполнении данной процедуры важно помнить, что контрольные и экспериментальные образцы всегда должны обрабатываться одновременно и в одинаковых условиях для минимизации вариабельности данных. После завершения этой процедуры анализ также может быть расширен на трехмерный объем для получения дополнительных данных о локализации стрессовых гранул.

Эта полуавтоматическая процедура позволяет проводить строгий и объективный анализ стресс-гранул в неинфицированных и инфицированных клетках. Она может выявить ранее неизвестные способы нарушения пути формирования стресс-гранул. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как инфицировать клетки бактериями, как индуцировать образование стресс-гранул и как использовать полуавтоматический подход для качественного и количественного анализа стресс-гранул.

Также не забывайте, что работа с Shigella flexneri и агентами, индуцирующими образование стресс-гранул, такими как clotrimazole, может быть опасной, и необходимы такие меры предосторожности, как использование перчаток, работа в лаборатории уровня BSL-2 и надлежащая утилизация всех реагентов.