Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

Описывается метод качественного и количественного анализа образования гранулятов стенок в клетках млекопитающих после того, как клетки заражены бактериями и рядом различных стрессов. Этот протокол может быть применен для исследования реакции гранулы клеточного стресса в широком диапазоне хост-бактериальных взаимодействий.

Общая цель этого эксперимента — оценить влияние бактериальной инфекции на способность клеток-хозяев образовывать стрессовые гранулы в ответ на экзогенный стресс. Этот метод является ценным инструментом в области клеточной микробиологии для оценки того, способен ли данный патоген изменять или подрывать весь путь стрессовых гранул. Основное преимущество этого метода заключается в том, что гранулы напряжения могут быть качественно и количественно проанализированы строгим и автоматизированным образом с помощью бесплатных программ анализа изображений.

Этот метод позволяет получить представление о динамике образования и составе стрессовых гранул и о том, как на эти параметры влияет конкретный патоген. Спасибо. Прежде чем приступить к испытанию, инокулируйте колонию красных бактерий S.flexneri M90T из свежеиспеченной пластины триптического соевого агара 1% конголезского красного агара в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую восемь миллилитров триптического соевого бульона.

После закручивания крышки инкубируйте колонию в течение ночи с встряхиванием при 222 об/мин и 30 градусах Цельсия. На следующий день субкультурировали 150 микролитров бактерий в восьми миллилитрах свежего триптического соевого бульона в течение примерно двух часов при 37 градусах Цельсия и 222 оборотах в минуту, чтобы инициировать позднюю экспоненциальную фазу индукции экспрессии генов вирулентности и повысить инфекционность бактерий. Когда оптическая плотность субкультуры составляет от 0,6 до 0,9, перенесите один миллилитр бактерий в 1,5-миллилитровую пробирку для их сбора методом центрифугирования.

И повторно суспендировать гранулу в инфекционной среде при оптической плотности единицы. Затем аспирируйте надосадочную жидкость из каждой лунки культуры покровного стекла клеток HeLa. И тщательно промойте клетки HeLa 500 микролитрами свежей клеточной среды HeLa комнатной температуры на лунку.

Замените промывку 500 микролитрами инфекционной среды на лунку и центрифугируйте 24-луночный планшет, чтобы бактерии попали на клетки. Перенесите осевшие бактериальные кокультуры в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, чтобы облегчить инфицирование клеток-хозяев. В конце инкубации удалите экзогенные бактерии из клеток с помощью трех полосканий в одном миллилитре свежей питательной среды HeLa при температуре 37 градусов Цельсия на одну промывку.

Затем накройте зараженные клетки одним миллилитром свежей питательной среды, содержащей гентамицин, и верните планшет в инкубатор для клеточных культур. В конце инкубации замените среду 500 микролитрами соответствующей питательной среды, дополненной интересующим стрессором, и верните клетки в инкубатор для тканевых культур. Через час полностью отасканируйте надосадочную жидкость и зафиксируйте образцы в 0,5 миллилитрах комнатной температуры 4% параформальдегида в PBS на 30 минут.

Затем выбросьте фиксатор в соответствующий контейнер для отходов и промойте покровные стекла одним миллилитром трис-буферизованного физиологического раствора в течение двух минут, осторожно встряхивая. В конце промывки полностью аспирируйте TBS и пропитайте клетки в каждой лунке 500 микролитрами 0,3% Triton X-100 в TBS. Через 10 минут замените проникающий раствор одним миллилитром TBS, аккуратно взболтайте пластину и замените TBS одним миллилитром блокирующего раствора на один час при комнатной температуре.

Чтобы пометить клетки коктейлем первичных антител, нанесите 50 микролитров первичной смеси антител на кусок пластиковой парапленки, плотно прикрепленный к столешнице. Затем с помощью пинцета подхватите первый покровный лист. И промокните край покровного листа на листе папиросной бумаги, чтобы удалить лишнюю жидкость.

Осторожно положите покровный лист на каплю и инкубируйте покровные листы в соответствующих условиях маркировки. В конце инкубации первичного мечения антителами перенесите каждую покровную крышку в отдельную лунку нового планшета на 24 лунки, содержащую один миллилитр TBS на лунку, и промойте клетки при комнатной температуре на шейкере для планшетов в течение пяти минут три раза. После последней промывки пометьте клетки на каждом покровном листе соответствующей смесью коктейлей вторичных антител, как показано выше.

И инкубируйте покровные стекла в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. По окончании инкубации вторичного мечения антителами промойте клетки в одном миллилитре PBS три раза в новой 24-луночной пластине с легким встряхиванием, как только что продемонстрировано, но защищенным от света. После последней промывки кратко окуните каждую защитную крышку в деионизированную воду, чтобы удалить соль, промокните края защитного стекла на салфетке и осторожно установите защитные стекла на пять микролитров флуоресцентной монтажной среды на предметное стекло микроскопа без пузырьков.

Затем заклейте покровное стекло лаком для ногтей. И храните слайды по мере необходимости до получения изображения. Чтобы получить изображение клеток с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии, начните с выбора подходящего объектива и подходящих флуоресцентных каналов для получения изображения.

Затем получите стеки изображений клеток с помощью соответствующего программного обеспечения для визуализации. Когда все изображения будут сняты, используйте соответствующее программное обеспечение для анализа изображений, чтобы свернуть стопки изображений и сохранить их в виде файлов TIFF. Затем загрузите элемент управления и экспериментальное изображение в формате TIFF на платформу анализа изображений и выберите Таблица поиска, чтобы открыть параметры канала в окне Sequence

Установите флажки на вкладке «Все каналы», чтобы отключить все каналы. Затем нажмите на нулевой канал и нажмите на полосу цвета нулевого канала, чтобы выбрать предпочтительный цвет, увеличивая интенсивность канала по мере необходимости для визуализации всех структур. После выбора и настройки каждого из подходящих цветовых каналов для экспериментального анализа выберите вкладку холста и настройте вкладку масштабирования так, чтобы визуализировать около 10 ячеек на поле просмотра.

С помощью инструмента «Многоугольник» щелкните по интересующей вас ячейке и продлите линию вокруг ячейки, чтобы обозначить границу ячейки. Чтобы назвать эту область интереса, в окне области интереса щелкните правой кнопкой мыши по ячейке интереса и дважды щелкните по названию области интереса, чтобы изменить его. После выбора и присвоения имен всем интересующим ячейкам таким же образом, откройте приложение «Детектор пятен» на вкладке «Обнаружение и отслеживание».

Откройте вкладку Предварительная обработка и выберите канал для анализа. На вкладке Детектор выберите Обнаруживать яркие пятна на темном фоне и выберите подходящий масштаб и чувствительность. На вкладке «Область интереса» выберите предложенную область интереса из эпизода.

На вкладке Фильтрация выберите Без фильтрации. На вкладке Выходные данные выберите соответствующие выходные данные. Выберите Удалить предыдущие пятна, отображаемые как области интереса, и щелкните Нет выбранного файла, чтобы выбрать папку для сохранения файла.

Затем на вкладке «Отображение» выберите подходящие параметры и нажмите «Начать обнаружение». В программном обеспечении для анализа изображений точечный детектор может использоваться для идентификации гранул напряжения в каждой из обозначенных областей интереса. Затем может быть сгенерировано двоичное изображение для отображения всех идентифицированных гранул напряжения.

Анализ гранул напряжения должен быть тщательно адаптирован к каждому анализируемому рынку гранул напряжения. Например, изменение требований к размеру обнаруживаемой области или изменение чувствительности параметров обнаружения приводит к различным результатам. При больших масштабах размера пикселя меньшие гранулы напряжения не будут учитываться, а количество гранул напряжения уменьшится.

В то время как повышение чувствительности приводит к увеличению количества гранул напряжения. Например, в этом эксперименте шкала из двух баллов с чувствительностью 100 дала наилучший результат от маркера гранул напряжения G3BP1. В то время как шкала двойки с чувствительностью 55 дала наилучший результат для маркера гранул напряжения EIF3B.

Затем площадь поверхности может быть рассчитана на основе размера гранул напряжения. Графики частотного распределения полезны для выделения сдвигов в размерах стрессовых гранул между различными популяциями клеток. Кроме того, интенсивность флуоресценции может предоставить информацию о качестве анализируемых гранул напряжения.

После освоения вся клеточная проба может быть выполнена примерно за шесть-семь часов, а анализ может быть завершен еще через два-три часа. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что контрольная и экспериментальная выборки всегда обрабатываются одновременно и в одних и тех же условиях, чтобы свести к минимуму изменчивость данных. После этой процедуры анализ также может быть расширен до трехмерного объема, чтобы получить дополнительное представление о локализации гранул напряжения.

Эта полуавтоматическая процедура позволяет проводить строгий и объективный анализ стрессовых гранул в неинфицированных и инфицированных клетках. Он может выявить ранее неизвестные подверсии пути прохождения стрессовых гранул. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как заражать клетки бактериями, как вызвать образование стрессовых гранул и как использовать полуавтоматический подход к качественному и количественному анализу стрессовых гранул.

И не забывайте, что при использовании Shigella flexneri и стрессовых гранул такие агенты, как клотримазол, могут быть опасными, и что необходимы такие меры предосторожности, как ношение перчаток, работа в лаборатории BL2 и правильная утилизация всех реагентов.